小鼠基因敲除是分析基因功能的经典遗传学技术，可以完全灭活小鼠的某个基因。细胞内存在一些特别的机制，如RNA干扰(RNA interference, RNAi)，从RNA水平调控基因的表达水平。这些机制可以人为地用来调低基因的表达水平。基因敲低动物模型其实是一种表达RNAi的转基因动物，通过随机插入或定点敲入的方式整合入基因组，利用RNAi机制调低某种基因的表达水平。

RNAi最早是在美丽线虫(C.elegans)中发现的。十多年前，科学家们发现在动物细胞内存在一种基因表达调节机制，称为RNAi。RNAi是一个序列特异的基因沉默机制，在mRNA水平起作用，通过降解mRNA抑制基因的表达。RNAi技术是研究基因功能的强大工具。其特点是简单、便宜、快速，主要在细胞系中使用，其技术亦可用于产生转基因动物，用于在体内研究基因功能。尽管RNAi不能够完全灭活基因，但在许多情况下，特别是计量依赖型基因，调低基因表达足以产生表型变化，以确定基因功能。

在无脊椎动物中，长双链RNAs(double-stranded  RNA，dsRNA)通过核糖核酸酶被加工成短的干扰 RNAs(small interfering RNAs, siRNAs)。siRNA反义链作为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced  silencing complex, RISC)的一个模板起作用，RNA诱导的沉默复合体识别并切割引导自身快速降解的完整mRNA。在哺乳类动物中，长双链dsRNAs(≥30bp)会引起干扰素反应，造成蛋白质合成的大面积非特异性mRNA降解。然而，如果它们的长度短于30bp，人工合成的短dsRNAs可以引发在哺乳动物细胞中没有干扰素诱导的mRNAs的特异性降解。

设计RNAi表达载体合成互补的正义链和反义链，与靶mRNA互补。正义链和反义链之间含有一段非互补的序列，这些序列形成一个含有颈环结构的转录物，可以向后折叠并且形成短的发夹 RNAs(short hairpin RNA,shRNAs)，这些发夹RNAs被Dicer加工成siRNAs。由于这些载体可以稳定地整合进基因组，可以在转基因动物体内永久性使靶基因沉默(图3-15)。

图3-15 RNAi介导的基因敲低示意图

通过受精卵原核注射，慢病毒载体感染的ES细胞，通过重组酶介导的基因盒交换(RMCE)或同源重组进行的靶向基因敲入等方法可产生转基因的shRNA小鼠。目标基因沉默的效率可高达90％或更高。使用这一技术，还可产生条件性的转基因沉默。这一技术已成功用于制备Tangier疾病的小鼠模型(ABCA-1缺陷)、糖尿病小鼠模型以及条件性沉默大脑特异性的丝裂原活化蛋白激酶的小鼠模型。

起先，基因敲低载体的设计是将shRNA直接放在启动子后面。最近，Stegmeier等人报道启动子和shRNA存在间隔序列(如GFP)可以增强shRNA的效果，并且可得到强的GFP表达。Lowe课题组建立了大规模制备转基因的shRNA小鼠的方法。 shRNA融合在GFP后，可以用GFP的表达跟踪 shRNA的水平。

利用基因敲入的方法也可以产生RNAi小鼠。但是，由于全身性的基因敲低对某些致死性基因来说是难以实现的，所以人们开始寻求Cre、LoxP介导的条件性RNAi。研究者们在RNAi载体的shRNA正义链和反义链前插入floxed-stop codon，然后通过基因敲入导入ROSA26位点，通过特异性表达的Cre重组酶控制RNAi的组织特异性。也可以向 shRNA启动子区插入正筛选基因如flox PGK-neo来阻止shRNA转录的方式实现Cre/LoxP特异性调控shRNA基因敲入小鼠的基因表达。

RNAi转基因提供了一个替代同源重组用于体内研究基因功能的可塑性和系统性方法。尽管RNAi不能取代基因打靶用于产生精确基因修饰，但RNAi可以独特、快速、可靠、经济地产生转基因小鼠。可在一定的时空里可逆地抑制内源性基因。