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质粒的提取方法
2015年09月17日
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：质粒的提取方法
碱裂解法提取质粒DNA操作步骤
(1) 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB(含Amp100ug/ml)液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜(约12-14hr)。
(2) 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。
(3) 菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。
(4) 加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
(5) 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。 12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
(6) 上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp离心10min。(450μl的苯酚/氯仿/异
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戊醇)
(7) 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心12000rmp×10min。
(8) 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。
(9) 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
(10) 将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。
2.10.2 实验试剂及配制：
(1) LB液体培养基
称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
(2) 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
(3) 溶液Ⅰ
50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
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(4) 溶液Ⅱ
0.2M NaOH，1% SDS
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
(5) 溶液Ⅲ：
醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
(6) 苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
(7) 无水乙醇
(8) 70%乙醇
(9) TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
1M Tris-HCl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷)配制：800ml H2O中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L。
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0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)：700mlH2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH调 pH8.0(需约50ml)，补H2O到 1L。
(10) RNA酶A母液：
将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
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