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菌落总数检验
2015年09月29日
来源：原创
作者：李晓菲
责任编辑：admin
摘要：菌落总数检验
1. 目的
检测实验动物生活环境。主要包括饲料、垫料、饮水等卫生状况，判断微生物污染程度。
规范菌落总数检验的基本原则、技术要求和方法。
2.内容
2.1设备材料
2.1.1冰箱：0℃～4℃。
2.1.2恒温培养箱：36℃±1℃。
2.1.3恒温温水浴锅：46℃±1℃。
2.1.4均质器或灭菌乳钵。
2.1.5架盘药物天平：0g～500g，精确至0.001g。
2.1.6菌落测定器。
2.1.7放大镜4×。
2.1.8灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml（具0.1ml刻度）。
2.1.9灭菌锥形瓶：500ml。
2.1.10灭菌玻璃珠：直径约5mm。
2.1.11灭菌培养皿: 直径约90mm。
2.1.12灭菌试管：16mm×160mm。
2.1.13灭菌刀、剪子、镊子等。
2.1.14 pH计或精密pH试纸。
2.2 培养基和试剂
2.2.1平板计数琼脂（PCA）培养基
2.2.2 磷酸盐缓冲液
2.3 操作步骤
2.3.1样品稀释及培养
2.3.1.1固体和半固体样品：无菌操作称取25g，置于含有225ml稀释液或灭菌生理盐水其他的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳 钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的样品稀释液。固体样品最好用均质器，以8000r～10000r/min的速度离心1min，做成1:10的均匀样品稀释液。
2.3.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于225ml磷酸缓冲液或灭菌生理盐水的无菌均质杯中(瓶内放置适当数量的玻璃珠)，充分混匀，制成1:10的样品稀释液。
2.3.2 用1ml灭菌吸管吸取1:10样品稀释液1ml，沿管壁慢慢注入含有9ml磷酸缓冲液或灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1:100的样品稀释液。
2.3.3 另取1ml灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
2.3.4 根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2个～3个适宜稀释度，分别再做10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品稀释液加入两个灭菌培养皿内，同时分别吸取1ml稀释液加入两个培养皿作空白对照。
2.4 培养
2.4.1 样品稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46℃琼脂培养基（可放置于46℃±1℃水浴保温）注入培养皿约15ml～20ml，并转动培养皿使混合均匀。同时将琼脂培养基倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿内作空白对照。
2.4.2 待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃温箱内培养48h±2h。
2.5 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌菌计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units,cfu)表示。
2.5.1 选取菌落数在30cfu～300cfu之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
2.5.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
2.5.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
2.6 结果的表述
2.6.1 菌落总数的计算方法
2.6.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数的适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(或毫升)中菌落总数结果。
2.6.1.2 若有两连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算；
N=c/(n1+0.1n2 )d …………………(1)
式中：N-样品中菌落数；
C-平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n1-第一个稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2-第二个稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d-稀释因子(第一稀释度)。
示例:
稀释度 1：100(第一稀释度) 1：1000(第二稀释度)
菌落数 232.244 33.35
2.6.1.3 若所有稀释度的平皿上菌落数均大于300；则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
2.6.1.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2.6.1.5若所有稀释度（包括液/固体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
2.6.1.6若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2.7 菌落总数的报告
2.7.1菌落数在100以内时，按"四舍五入"原则俢约，采用两位数报告。
2.7.2 大于100时，第三位数字采用"四舍五入" 原则俢约后取前两位数字，后面用0代替位数，也可用10的指数来表示(见表1)，按"四舍五入"原则俢约，采用两位数报告。
2.7.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数时，则报告菌落蔓延。
2.7.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
2.7.5 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/ml为单位报告。
2.8 实验动物配合饲料微生物指标见表。
实验动物配合饲料微生物指标参照值
|
项目 |
动物种类 |
|||||
|
项目 |
小鼠大鼠 |
兔 |
豚鼠 |
地鼠 |
犬 |
猴 |
|
菌落总数，cfu/g ≤ |
5×104 |
1×105 |
1×105 |
1×105 |
5×104 |
5×104 |
|
大肠菌群，MPN/g ≤ |
30 |
90 |
90 |
90 |
30 |
30 |
|
霉菌和酵母菌，cfu/g ≤ |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
致病菌（沙门氏菌） |
不得检出 |
|||||
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