【摘要 】 目的 观察补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠学习记忆功能的影响 。 方法 33只 SD大鼠分成假手术组 ( n = 10) ,模型组 ( n = 11)和补阳还五汤组 ( n = 12) 。 线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞模型 ,术前 7 d开始灌胃 (13. 3 g/kg) ,连续给药 21 d, 1次 /d。 缺血后第 1～28天进行神经症状评分 ,第 30～35天采用八臂迷宫评价学习记忆功能 。 结果 缺血后第 32、34和 35天 ,补阳还五汤组大鼠总错误次数分别为(3. 21 ±0. 47)次 、 (1. 94 ±0. 59)次和 (1. 48 ±0. 51)次 ,参考记忆错误次数分别为 (2. 46 ±0. 52)次 、(1. 44 ±0. 53)次和 (1. 15 ±0. 57)次 ,与模型组比较差异有显著性 ( P < 0. 05) ,但补阳还五汤对工作记忆错误次数没有影响 ( P > 0. 05) ;补阳还五汤在缺血后 14 d内能显著改善神经症状 ( P < 0. 05或 P < 0. 01) 。结论 补阳还五汤能显著改善脑缺血恢复期大鼠学习记忆能力 。

【关键词 】 局灶性脑缺血 ; 学习 ; 工作记忆 ; 参考记忆 ; 补阳还五汤；八臂迷宫实验

补阳还五汤是临床治疗脑缺血后遗症的代表方剂 ,但目前有关补阳还五汤对脑缺血的实验研究主要集中在急性期 。 本研究进一步观察补阳还五汤对脑缺血恢复期学习记忆功能影响 。
材料与方法
一、材料
1. 动物 : SD 大鼠 ,雄性 ,浙江省实验动物中心提供 ,体质量 250～300 g,二级动物 ,自由饮食进水 。
2.药物 :补阳还五汤处方来源《 医林改错 》,黄芪120 g,当归 6 g,川芎 4. 5 g,赤芍 4. 5 g,地龙 3 g,红花3 g,桃仁 3 g,药材购自浙江中医学院附属门诊部并经鉴定。

3.仪器：八臂迷宫实验装置由上海欣软信息科技有限公司提供。

二、方法
1. 线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞模型 : 参照Longa等方法 ,大鼠用 100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg) 。 分离右侧颈总、颈内和颈外动脉 ,从颈外动脉插栓线 (直径约 0. 26mm)进入颈内动脉直至大脑中动脉 ,距颈总动脉分叉处约 18～20mm。 缺血 90m in后将栓线缓慢拔出 ,结扎颈外动脉。 术中用电热板和白炽灯加温 ,维持肛温在 37℃左右 。 假手术组只分离血管 ,不插栓线。
2.分组与给药 :采用完全随机法将大鼠分成 3组。补阳还五汤组 ( n = 12) ,从术前 7 d开始灌服补阳还五汤 (13. 3 g/kg) ,持续到缺血后 14 d, 1次 /d。 假手术组 ( n = 10)和模型组 ( n = 11)灌服等量生理盐水。
3. 神经症状缺失评分 :采用 Longa等评分标准 。
4.八臂迷宫检测学习记忆能力 :参照 Chen等方法。 迷宫距地面高 50 cm , 中 间八 边形平 台直 径24 cm,臂长 50 cm,宽 10 cm,高 50 cm。 在每个臂的顶端有一个强化用的食物杯 ,直径 3 cm ,深 0. 5 cm。 在放迷宫的房间四周安放一些明显的视觉标志。 在实验开始和整个过程中限制进食 ,控制大鼠的体质量在自由饮食时的 80% ～85% ,自由饮水。 缺血后第 28、 29天适应。 第 1天将饵散放在迷宫的八个臂内和平台上 ,每次放 2～3只大鼠 ,让其自由进食 。 第 2天开始将饵只放在臂内 ,然后只放在食物杯内 ,使大鼠熟悉到杯内
寻找食物 。 缺血后 30～35 d进行学习获得能力训练 。在迷宫的其中四个臂 (1、2、4、7号臂 )放入饵。 实验开始前将大鼠放在中央平台 ,用一个不透明的塑料桶罩住 , 15 s后提起 ,让大鼠在迷宫内自由活动 ,当大鼠将饵吃完或 5m in 后 ,实验结束 。 每天训练 4 次 ,连续6 d。 观察指标 : (1)总错误次数 ,即大鼠进入没有饵的臂 (包括已吃完和未放饵的臂 )的次数 ; (2)工作记忆错误次数 ,工作记忆错误是指大鼠再次进入开始放有饵的臂 ; (3)参考记忆错误次数 ,参考记忆错误是指大鼠第 1次进入没有放饵的臂。
5. 统计学处理 :数据用 x ±s表示 ,采用 SPSS10. 0软件进行非参数 Mann2 W hitney u检验。
结 果
一、补阳还五汤对脑缺血大鼠神经症状的影响补阳还五汤在缺血后 1～14 d能明显改善神经症状。 其中在缺血后第 3, 5, 7天差异有非常显著性 ( P< 0. 01) ,第 1, 14天差异有显著性 ( P <0. 05) ,结果见表 1。
二、补阳还五汤对脑缺血大鼠学习记忆的影响
假手术组在训练结束后已基本学会。 与模型组比较 ,补阳还五汤组在缺血后第 32, 34, 35天能显著减少总错误次数和参考记忆错误次数 ( P < 0. 05) ,但对工作记忆错误次数没有影响 ( P >0. 05) ,结果见表 2～ 表 4。

讨 论
迄今为止 ,尚无一种普遍满意的测试学习记忆的行为学模式 ,常用方法有 Y迷宫 、水迷宫等。 相对而言 ,八臂迷宫操作简便 、可行 ,而且能区分短期的工作记忆和长期的参考记忆 ,现已被广泛用于学习记忆功能评价 。
大脑中动脉阻塞后 ,缺血大鼠感觉运动和学习记忆能力明显下降 ,这与 Ellsworth等报道一致。 我们根据预实验结果 ,结合文献报道 ,选择给药剂量13. 3 g/kg连续灌胃 21 d,发现补阳还五汤能显著减少总错误次数和参考记忆错误次数 ,提高脑缺血大鼠的学习记忆能力。 由于大鼠脑缺血后神经症状恢复很快 ,补阳还五汤只在缺血后 14 d内能显著改善神经症状 ,缺血后第 28 d,已基本无运动障碍 。
脑缺血导致行为学缺失和恢复的神经生物学机制还不清楚 。 急性期减少神经元死亡和恢复期促进神经再生都有助于神经功能恢复。 大鼠大脑中动脉阻塞后VD小鼠海马 CA1区 CHAT及其 mRNA表达下降。 说明两者水平降低与 VD 发病有关 ,至于其下降的可能原因 : ① 反复缺血 - 再灌注导致神经元凋亡 ; ② 前列腺凋亡反应 4 (p rostate apop tosis response24, Par24)具有降低 CHAT蛋白质水平、阻止细胞增加 CHAT活性的能力、激活 caspase家族半胱氨酸蛋白酶、诱导死亡基因的表达等作用 [ 5、 6 ] ,而 Par24在脑缺血后含量升高 。因此研究中 CHAT及其 mRNA 的下降可能与反复缺
血 - 再灌注使 Par24水平升高有关 。 ③CHAT受钙调素激酶 Ⅱ 等蛋白激酶的磷酸化调节 ,这种磷酸化作用可以调节 CHAT的活性 。吕佩源等曾研究发现VD小鼠海马神经细胞钙调素激酶 Ⅱ的 mRNA 表达下降 ,因此 , CHAT及其 mRNA表达降低与钙调素激酶 Ⅱ的 mRNA低表达有关。
石杉碱甲作为一种促智药 ,传统观点认为其高效 、可逆抑制胆碱酯酶 ,进而改善痴呆者认知功能 。 现今认为其具有多重药理作用。 首先它具有抗氧自由基 、抗细胞凋亡 、抗谷氨酸受体等神经保护作用 ,因此 ,该药通过纠正海马神经细胞缺血、缺氧状态 ,改善了CHAT及其 mRNA的表达 ;其次 ,吕佩源等曾研究发现石杉碱甲能显著改善 VD小鼠海马钙调素激酶 Ⅱ的mRNA的表达 ,增高的钙调素激酶 Ⅱ通过其磷酸化作用 ,进一步增强了 CHAT的活性。
综上所述 ,海马神经元 CHAT及其 mRNA 的表达降低参与了 VD 的发病 ,石杉碱甲通过多靶点的药理机制 ,提高了海马两者的表达 ,改善了 VD 小鼠海马的胆碱能系统功能 ,进而提高了 VD 小鼠的学习、记忆成绩。