实验方法
饮食诱导法构建动脉粥样硬化动物模型
饮食诱导法
不同动物对胆固醇的反应是完全不同的,其中以家兔对胆固醇的反应最为敏感,而啮齿类动物(如小鼠、大鼠)对胆固醇几乎不反应。1908年,俄国病理生理学家Ignatowski用富含动物蛋白的饮食饲喂家兔,以此诱导动脉粥样硬化病变,开启了动脉粥样硬化实验研究的新时代。因而,家兔是饮食诱导研究动脉粥样硬化的理想动物模型。
【造模机制】动物机体脂质代谢紊乱,血脂升高,容易引起血管内皮损伤,导致血管内皮功能紊乱、通透性增高,最终导致血管壁的脂质浸润、形成动脉粥样硬化。因此,通过给实验动物饲喂高脂、高胆固醇饮食,出现高脂血症,进而诱导其主动脉及冠状动脉逐渐形成粥样硬化斑块。在高脂、高胆固醇饮食中加入少量胆酸盐,可以增加胆固醇的吸收;加入甲状腺抑制药物如甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶,可进一步加速动脉病变的形成。
【造模方法】
家兔:选用4月龄左右雄性日本大耳白家兔或新西兰家兔,给予含0.3%胆固醇饮食(建议饮食中胆固醇水平小于0.6%),可使家兔血浆胆固醇迅速升高,6周后家兔主动脉弓可出现明显动脉粥样硬化斑块。随着饲喂时间延长,可诱导家兔胸主动脉、腹主动脉、冠状动脉出现粥样硬化斑块。
小型猪:选用3~6月龄小型猪。致动脉粥样硬化饮食配方:胆固醇1.5%~2%,牛油10%,花生油6%。胆盐0.5%~1%,基础料82%~83%。通常按体重3%饲喂小型猪。
大鼠:含胆酸和硫脲嘧啶的高脂、高胆固醇饮食诱导大鼠产生高脂血症及动脉粥样硬化。此外,给大鼠饲喂高胆固醇饮食,同时给予大量维生素D2能使血浆胆固醇水平升高,主动脉和冠状动脉出现粥样斑块。
小鼠:选用6~8周C57BL/6小鼠,用含胆固醇1.25%、胆酸0.5%和脂肪15%的饮食饲喂10周,能诱导出动脉粥样硬化早期病变。
其他动物:选用4~8周家鸡,给予高胆固醇(1%~2%)、高脂肪(5%~10%猪油)饮食,经过6~10周,胸主动脉粥样斑块发生率达100%。鸽子每天饲喂胆固醇3g/kg,加甲基硫氧嘧啶0.1g,可以产生比较明显的粥样斑块。
【模型特点】
家兔:高脂饮食中胆固醇含量达0.2%~2.0%,就可使家兔血浆中胆固醇浓度迅速升高,出现高胆固醇血症,启动动脉粥样硬化的发生发展。随着饮食中胆固醇含量增加及喂养时间延长,家兔动脉壁的斑块逐渐增大。但是,饮食中胆固醇含量越高毒性也越大。一般而言,用0.3%胆固醇饮食饲喂家兔,2周后家兔血浆胆固醇水平可以达到400~500mg/dl,血管内皮下细胞外脂质开始沉积,单核细胞和巨噬细胞浸润并出现脂滴;4~8周时,家兔血浆胆固醇水平上升到800~1200mg/dl,主动脉出现脂肪条纹,内含由巨噬细胞转化的泡沫细胞;12~16周时,脂肪条斑变成由细胞内外脂质沉积形成的复杂纤维斑块,平滑肌细胞也转化为泡沫细胞,胶原纤维合成增加,胆固醇结晶体析出。28周以后,家兔主动脉可逐渐形成粥样斑块并呈现复合性病变;冠状动脉出现明显病变。图5-1/文末彩图5-1示0.3%胆固醇饮食诱导家兔16周后动脉粥样硬化病变情况。
猪:生理和解剖与人类有一定相似性。随着年龄的增长,可自发轻度动脉粥样硬化,通常以高胆固醇饮食来加速动脉粥样硬化的发生。高脂、高胆固醇饮食诱发动脉粥样硬化病变主要发生于腹主动脉,这点与小鼠和家兔不同。高脂、高胆固醇饮食饲喂4~12个月,主动脉脂肪条纹病变进展主要表现为内膜隆起高度、病变范围、血管壁厚度逐渐增加。主动脉纤维斑块病变进展表现为斑块范围的扩大、隆起高度增加。猪动脉粥样硬化脂纹期短暂,很快发展为较厚的纤维斑块。8个月左右出现脂质核,12个月左右出现钙化灶和胆固醇结晶,伴有中膜平滑肌变性、坏死和增生等病变。
大鼠:血浆中不含胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP),血浆胆固醇水平较低。大鼠对饮食中的胆固醇不敏感。单纯高胆固醇饮食不易升高大鼠血浆胆固醇,很难诱导动脉粥样硬化。即使长期给予高胆固醇饮食,大鼠也只能形成中度动脉粥样硬化病变,这就限制了大鼠在动脉粥样硬化疾病研究中的应用。
小鼠:小鼠也缺乏CETP,由于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平和低胆固醇吸收率,大多数小鼠品系对饮食中胆固醇不反应,血浆胆固醇不升高,故很难诱导出动脉粥样硬化斑块。但是,近交系小鼠对饮食诱导的动脉粥样硬化则表现出一定程度的敏感性。用含胆固醇1.25%、胆酸0.5%和脂肪15%的饮食饲喂10种近交系小鼠,发现它们对动脉粥样硬化敏感程度从低到高排序如下:BALB/cJ<C3H/J<A/J<SWR/J<NZB/J<129/J<AKR/ J<DBA/2J<C57L/J<C57BL/6。单一胆固醇(含量0.5%~1%)饮食不能诱导小鼠产生有统计学意义的血脂变化及主动脉损伤,且单一胆酸(0.1%~0.5%)饮食也不能诱导小鼠血脂升高及主动脉损伤。可是,含1.25%胆固醇、0.5%胆酸的饮食能诱导 C57BL/6小鼠出现动脉粥样硬化病变,其早期斑块(脂肪条纹)在形态学上与人类斑块相似,但病情进一步发展之后,其病变部位仍然局限于主动脉弓部,且斑块不连续、特点不典型。
【模型评估和应用】家兔体型适中,脂蛋白组成和脂蛋白代谢特点与人相似,如血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)含量高,肝脏能合成ApoB100,不能编码ApoB48 mRNA,血浆中富含 CETP,高胆固醇饮食容易诱发动脉粥样硬化病变。所以,家兔是饮食诱导动脉粥样硬化最常见的动物模型。然而,家兔动脉粥样硬化的特征与人类还是有些差别,如发病部位与人类不一样,家兔易发于主动脉弓和胸主动脉,而人类易发于腹主动脉;家兔不易发生并发症,而且病理损伤更接近于黄瘤病,这与人类不一样;另外,家兔属于草食性动物,对食物的利用和代谢也与人类存在差异。