实验方法
基因修饰动脉粥样硬化动物模型
基因敲除小鼠和转基因家兔是研究脂蛋白代谢和动脉粥样硬化的重要模型，为模拟人类动脉粥样硬化发生、发展，研究病理机制提供了新方法。
(一)基因敲除小鼠
【造模机制】应用胚胎操作技术和DNA同源重组原理，定向将靶基因片段用基因缺失片段替代，从而制备基因敲除小鼠。最近，新的基因敲除技术不断开发应用，如锌指核酸酶、TALEN和 CRISPR/Cas9技术。动脉粥样硬化的发生和发展与脂质代谢关系最为密切，脂代谢中有两个重要基因即载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和LDLr。它们在胆固醇和甘油三酯转运过程中起重要作用。其中，ApoE是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)受体的配体，而LDLr是一种细胞膜表面的糖蛋白。ApoE或 LDLr基因的敲除，会引起血浆中低密度脂蛋白积累和血管重构，进而导致主动脉发生动脉粥样硬化病变。
【模型特点】基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变以主动脉流出道最早出现，渐进发展到主动脉弓部及头臂干分支，而且头臂干部位是后期斑块不稳定易发部位。后期严重的病变才会累及主动脉胸腹部。因此，主动脉流出道冷冻切片和主动脉en face油红O染色分析是评价动脉粥样硬化病变程度的公认标准。ApoE敲除(ApoE-/-)小鼠和LDLr敲除(LDLr-/-)小鼠是研究动脉粥样硬化最常用、最经典的两个模型。
1992年，美国洛克菲勒大学Plump等和北卡罗莱纳大学Piedrahita等同时应用胚胎干细胞基因敲除技术成功地制备了ApoE-/-小鼠。正常饮食条件下，ApoE-/-小鼠8周时血浆胆固醇水平为300～500mg/dl，比野生型小鼠高5倍，可自发动脉粥样硬化，病理过程呈渐进性发展，与人类病变过程相似，包括早期的脂质条纹。“西方饮食”(0.15％胆固醇，21％脂肪)等高脂饮食条件下，ApoE-/-小鼠血浆胆固醇水平可上升到1000mg/dl左右，加速动脉粥样硬化进程，长期诱导甚至可形成含纤维帽的复合病变，并出现斑块破裂形成血栓。
1993年，美国德克萨斯大学Ishibashi等成功构建了LDhr-/-小鼠模型。和ApoE-/-小鼠相比，正常饮食下，LDLr-/-小鼠血浆胆固醇约为200mg/dl，通过高脂饮食诱导，LDLr-/-小鼠血浆胆固醇能迅速上升至1000mg/dl左右，出现与ApoE-/-小鼠相似的动脉粥样硬化病变。
ApoE和LDLr双基因敲除(ApoE-/-/LDLr-/-)小鼠制备于1994年，此小鼠ApoB-100和ApoB-48显著升高，呈严重的高脂血症，动脉粥样硬化病变明显重于ApoE-/-小鼠。
【模型来源】美国Jackson实验室(http://www. jax.org/index.html)和国家遗传工程小鼠资源库(http:// www.nrcmm.cn/mice/index.asp)均可提供ApoE-/-和 LDLr--/-小鼠。
【模型评估和应用】ApoE-/-或LDLr-/-小鼠已经成为大多数动脉粥样硬化研究的工具小鼠，它们提供了一个动脉粥样硬化的易感背景，在此基础上，可以观察其他遗传或环境因素对动脉粥样硬化的影响。一般研究思路是：将其他转基因或基因敲除小鼠与ApoE-/-或LDLr-/-小鼠进行杂交，或通过骨髓移植方法，将基因修饰小鼠的骨髓移植到放射性核素照射的ApoE-/-或LDLr-/-小鼠，来观察巨噬细胞中某个基因对动脉粥样硬化的影响。
ApoE-/-小鼠可随年龄增加自发动脉粥样硬化，或通过高脂高胆固醇饮食诱发严重的动脉粥样硬化病变，但该模型的缺点是其胆固醇主要存在于 VLDL，而人类是LDL。而且，ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的个体差异较大，因此实验所需动物数量较大。与ApoE-/-小鼠相比，LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化病变较轻，但LDLr-/-小鼠血浆胆固醇主要存在于LDL，其脂蛋白分布更接近人类。更重要的是，LDLr-/-小鼠可经高脂饮食同步诱导动脉粥样硬化，病变个体差异小，可控性好，故实验所需动物数量较少。因而，近年来的动脉粥样硬化研究更倾向于使用LDLr-/-小鼠模型。ApoE-/-/LDLr-/-小鼠富含胆固醇脂蛋白代谢的配体和受体均发生缺陷，其动脉粥样硬化病变更严重，但由于实验设计上涉及更多因素，故应用较少。
小鼠模型的最大缺陷在于很难出现心脑血管病变，而人类动脉粥样硬化是以心脑血管病为临床表现，小鼠和人病变部位不同；导致小鼠无法成为心脑血管病合适的动物模型。因此，研发冠状和脑血管动脉粥样硬化模式动物是未来动脉粥样硬化动物模型的发展趋势。
(二)转基因家兔
【造模机制】家兔品系一般选用新西兰家兔或日本大耳白家兔。原核显微注射法是目前制作转基因家兔最常用的方法。制作转基因家兔时，将构建好的外源基因直接注射到受精卵的雄原核中，然后将携带外源基因的受精卵移植到同品系假孕受体雌兔的输卵管中，就可获得新生转基因仔兔。
【模型特点】家兔是继转基因小鼠之后发展起来、体型相对较大的动物模型。随着基因操作技术的发展，转基因家兔为研究脂蛋白和动脉粥样硬化易感性相关基因的作用提供了独特的工具。从1994年起，陆续培育成功表达人肝脂酶(hepatic lipase,HL)、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(lecithin- cholesterolacyltransferase,LCAT)、ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅱ、 ApoB-100、ApoE、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和金属基质蛋白酶12(matrix metalloproteinase-12,MMP-12)等一系列转基因家兔模型，并广泛应用于动脉粥样硬化研究。此外，人Apo(a)、ApoA-Ⅰ、LCAT和LPL基因等也已被导入到WHHL家兔体内，以进一步研究这些基因在脂蛋白代谢及动脉粥样硬化形成中的作用。
【模型来源】部分转基因家兔模型在日本佐贺大学综合分析实验中心生物资源开发部门(http:// www.animal.med.saga-u.ac.jp/index.php?id=1)保种、繁殖。
【模型评估和应用】与啮齿类动物相比，家兔在系统发育和进化上更接近人类。虽然转基因家兔已应用于脂质代谢和动脉粥样硬化方面的研究，但由于缺乏基因敲除家兔模型，基因修饰家兔模型还没有被广泛应用。
