广东省实验动物信息网

    全基因敲除是将目标基因用一段外源DNA序列(多数情况下是用于药物筛选的新霉素(Neomycin)抗性基因)来取代，从而达到使目的基因失活的目的。用于Conventional Knockout的基因打靶质粒构建相对简单。一般有一个阳性筛选基因（比如NeoR, Hygromycin Resistant Gene)和一个阴性筛选基因（如TK)。阳性筛选基因位于两个同源臂的中间，阴性筛选基因一般位于一个同源臂的外侧。阳性筛选基因类似于分子生物学实验中质粒上的氨苄等抗性基因。在转染小鼠胚胎干细胞之前，一般要对打靶载体进行线状化，然后利用电转仪通过电转的方式将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞内。线状打靶载体会整合到染色体上。在抗生素（比如G418）存在的情况下，只有染色体上重组了打靶载体的胚胎干细胞才能成活并增殖。如果是同源重组，阴性筛选基因会丢失，导致不能表达。如果是随机插入，一般会保留同源臂外的阴性筛选基因。传统上阴性筛选基因一般是用来自于HSV的胸苷激酶基因，这种激酶会将Gancyclovir转变成一个核苷类似物，并在基因组复制的过程中整合到新合成的DNA链上，造成DNA复制停止。所以，Gancyclovir能够抑制打靶载体随机插入的胚胎干细胞增殖。由于Gancyclovir经常会影响得到嵌合体小鼠后的种系传递，所以现在打靶载体很少再用TK基因做为阴性筛选基因了。目前最常用的是DTA(Diphtheria Toxin Subinit A, 白喉毒素A亚基）。在随机插入的情况下，如果有DTA表达，DTA可以直接杀死细胞，不需要再通过加入Gancyclovirs的方式进行阴性筛选。
如果不知道一个基因被敲除后会不会致死，最好是做条件性基因敲除。条件性基因敲除通过跟 Cre Deletor 小鼠交配，可以获得全敲除小鼠。而如果直接制备全敲除小鼠，一旦是致死基因，可能就需要重新开始做条件性敲除，造成时间和资金上的双重损失。