实验方法
CRISPR/Cas技术一次性构建多突变转基因鼠
Rudolf Jaenisch教授是MIT怀特黑德研究所（Whitehead Institute）的创始成员，在1974年，他通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，构建了第一只转基因小鼠，从而改变了遗传学研究。而现在，Rudolf Jaenisch教授将再一次革新基因修饰模式动物的生产技术，甚至有可能重新定义哪些物种可以作为模式物种。“我们现在可以在三到四个星期内生产一只携带5个突变的小鼠，而传统的技术要达到这一目标需要花费3到4年。并且这一技术相当简单，甚至可能比传统方法还要简便。
通过改变与特定疾病相关的基因，科学家们可以利用小鼠建立疾病模式。利用这些疾病模式动物，研究者可以对疾病的发生及发展，以及各种干预措施（包括遗传学与化学手段）对疾病的影响进行研究。在过去的20年中，建立疾病模式动物的方法基本没什么变化：首先将特定的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中，在将修饰过的干细胞植入到早期胚胎（即囊胚）中，然后将发育中的细胞移植到雌性小鼠中。通过这种方式建立单基因敲出的小鼠品系可能需要花费数年和数十万美元的成本。并且这种基因敲出的技术还仅局限于小鼠、大鼠等少数物种中应用。
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
据Rudolf Jaenisch教授的学生Chikdu Shivalila介绍，利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，“我们可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，我们进行单基因敲出的效率只有30%。” Shivalila相信这一技术将很快在需要建立基因突变鼠的研究机构中得到应用。
在目前的模式动物生产技术中，胚胎干细胞是一个绕不开的过程。而CRISPR/Cas技术则无需胚胎干细胞，因此遗传学研究可能将不再局限于有限数量的模式生物了。“这打破了模式生物的定义。现在，任何可以进行胚胎操作的动物都可以成为基因组工程的研究目标。由于许多动物的基因组已经完成测序，因此，利用这一技术我们可以在更多的物种中进行高效的遗传操作。”
同时研究者也指出，对于利用CRISPR/Cas技术构建模式动物还需要开展更进一步的研究，看是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变。
专家点评
上世纪80年代初，科学家们用显微注射的方法将外源DNA片段导入小鼠受精卵的原核中，构建出了第一个转基因小鼠。至今原核显微注射仍然是制备转基因动物的最常用的方法。然而该方法只能将外源DNA片段导入动物基因组中，无法对体内基因组的特定序列进行特定的修饰。80年代后期，由于小鼠ES细胞及同源重组技术的发展而催生的基因打靶技术使得科学家们可以对小鼠的任何基因序列进行随意的修饰，基因打靶技术的发展使生命科学的研究发生了革命性的改变，但用此技术制备基因工程动物模型花费较大，过程较长，而且由于基因的修饰是在ES细胞中进行，目前用基因打靶技术只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。
近几年，生物学家们发现，两种人工改造过的核酸酶ZFN和TALEN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。ZFN和TALEN技术结合了原核注射的制备周期短和基因打靶技术的定点修饰的特点，而且可以应用到除小鼠和大鼠之外的其他动物。但其脱靶效应（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
今年初以来，一种新的基因组修饰的技术CRISPR/Cas 受到人们的高度重视。 CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，目前仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
