实验方法
小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察
一、实验目的
1．初步掌握动物骨髓细胞染色体的制备方法。
2．了解小鼠骨髓细胞染色体的形态特点。
二、实验原理
染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定形式，是染色质紧密包装的结果。染色体是有机体遗传信息的载体，对染色体的研究在生物进化、发育、遗传和变异中有十分重要的作用。
核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图像，并将其剪裁排列即成，或用专用软件进行分析排列。
凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂期此时均可用于染色体分析。
在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。此时给动物注射一定剂量的秋水仙素可使许多处于分裂的细胞停滞于中期（ 秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装），然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可供分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作。
三、实验材料
实验器材：离心管、低速离心机、吸管、牙签、剪刀、载玻片、显微镜等。
实验试剂： 100µg/ml秋水仙素、0.075M KCl、Carnoy固定液、Giemsa 染液、pH6.8磷酸缓冲液、 0.85% NaCl生理盐水、0.4% KCl（低渗液）等。
小鼠腿一只
四、实验步骤
1．秋水仙素注射
称出小白鼠的体重，然后按2～4µg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3～4h后颈椎脱臼法处死。
2．取出股骨
取出小鼠后肢的股骨，剔除附着的肌肉，剪去股骨两端关节。
3．剪碎股骨于生理盐水
直接用手术剪将股骨剪碎于含有5 ml 0.85% NaCl的培养皿中，反复剪碎，使骨髓细胞析出，溶液成悬液状。
4．收集细胞
用吸管反复吸打细胞，使细胞团块分散，转入两支1.5ml离心管中。注意股骨碎片不要吸入离心管中。3000 rpm离心10分钟收集细胞。弃去上清。（注意：可合并两支管内沉淀）
5．室温低渗
加入0.4％KCl溶液1ml，轻微吸放混匀细胞，然后将离心管在室温下低渗20min。
6．Carnoy固定液预固定
低渗结束后在离心管中加入0.5ml Carnoy固定液进行预固定，用吸管轻微混匀，可避免细胞结块，室温固定5分钟后，混匀以2000 rpm离心10min。
7． Carnoy固定液重新固定
弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸(3:1)固定液1.5ml，用滴管小心将细胞团块打散，继续固定10分钟。
8．2000 rpm离心10分钟，留少量固定液后用滴管小心将细胞团块打散，制成均匀的细胞悬液。
9．在干净、湿冷的载玻片上以高距离滴2～3滴上层细胞悬液，气干或在酒精灯上文火烘干。注意在滴片时要有一定的高度（大于40cm），使细胞膜破裂后易于使染色体散开，并尽量使滴片上的细胞分布均匀，不要重叠。
10．气干，染色。
在一块洁净的玻板上，将玻片标本有细胞的一面朝下用牙签架空于玻板上。
11．用滴管将配好的染液充满于玻板与载玻片之间的空隙中，注意载片上有细胞面的进行染色并在滴加染液时注意排除气泡。视室温而定，染色15分钟。
12．染色后，轻轻揭起玻片，倾斜玻片在自来水管下细水流冲洗数秒，冲掉染液，擦干玻片标本底面和四周，显微镜观察和分析。注意不要搞错沾有细胞的一面。选择染色较好、较分散、形态清晰的细胞分裂相，进行显微观察。
五、结果与讨论
绘制染色体图 ：（小鼠骨髓细胞染色体）
对于小鼠骨髓细胞染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：
1．用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在分裂中期，使中期染色体停留在赤道面处。
2．用低渗法使将细胞膨胀， 以至于在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上。
3．空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平，经Giemsa染色后便可观察到染色体的图像。
4．倒置染色法：在玻璃板上用牙签做支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，然后用滴管在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，在操作时应注意，滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。此法一是可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。
