实验方法
人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立实验
2013年07月15日
来源：丁香园
作者：佚名
责任编辑：lmjinfo
摘要：人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立可以：（1）探讨肝恶性淋巴瘤发病机制；（2）为实验治疗提供工具；（3）为肝脏恶性淋巴瘤病因学和发病机制提供实验研究用的肿瘤动物模型。
人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立可以：（1）探讨肝恶性淋巴瘤发病机制；（2）为实验治疗提供工具；（3）为肝脏恶性淋巴瘤病因学和发病机制提供实验研究用的肿瘤动物模型。
实验方法原理：采用人肝恶性淋巴瘤术中新鲜组织块分别植入裸小鼠肝实质内和肩胛间皮下, 观察原位移植和皮下移植成瘤率, 移植瘤的侵袭、转移；并进行形态学(光镜、电镜、免疫组织化学) 、血清学[ 甲胎蛋白( AFP) 、乙型肝炎病毒表面抗原( H BsAg) 、乳酸脱氢酶( LDH) ] 检测，染色体核型和流式细胞分析。
实验材料：BALB C-nu nu 裸小鼠 肝恶性淋巴瘤新鲜标本
试剂、试剂盒：RPMI-1640 培养液 碘酊 酒精 在戊巴比妥钠 CD3抗体 CD7抗体 CD19抗体 CD20抗体 CD45RO抗体 CD79a 抗体
实验步骤：
一、实验动物准备
BALB/C-nu/ nu 裸小鼠，鼠龄4~ 6 周，体重17~ 20 g， 雌雄兼用，在无特定病原体( specific-pathogen free，SPF) 条件下本院裸鼠室内饲养。
二、标本来源
三、标本处理
四、皮下移植
1. 肝恶性淋巴瘤新鲜标本来自1 例53 岁男性患者，术前实验室检查除LDH 升高( 1 200 U / L) 、HBsAg 阳性外，肝功能、AFP、CEA 和骨髓象均正常。
2. 手术证实为肝多发结节型淋巴瘤，肝脏右叶呈多发性瘤结节，左叶由多个瘤结节融合为5. 3 cm ×3. 5 cm × 3. 0cm 肿块，切面灰白色鱼肉状， 结节中间部分黄白色，周边有红色不规则的充血带。
3. 术中未见其他组织、器官侵犯或远处淋巴结被累及，取肝左叶肿瘤结节病理诊断为肝脏非霍奇金B 细胞源性恶性淋巴瘤；慢性肝炎。
2. 手术证实为肝多发结节型淋巴瘤，肝脏右叶呈多发性瘤结节，左叶由多个瘤结节融合为5. 3 cm ×3. 5 cm × 3. 0cm 肿块，切面灰白色鱼肉状， 结节中间部分黄白色，周边有红色不规则的充血带。
3. 术中未见其他组织、器官侵犯或远处淋巴结被累及，取肝左叶肿瘤结节病理诊断为肝脏非霍奇金B 细胞源性恶性淋巴瘤；慢性肝炎。
三、标本处理
无菌切取的人肝恶性淋巴瘤活体瘤组织， 置入RPMI-1640 培养液中， 清除非瘤组织， 将其剪切成1 mm ×1 mm ×1 mm 组织小块，供移植用。
四、皮下移植
用2. 5% 碘酊和75% 酒精消毒裸鼠背部皮肤，用无菌套管针抽吸2 粒1 mm ×1 mm ×1 mm瘤组织块， 行颈背部皮下组织移植。
五、原位移植
五、原位移植
1. 裸鼠在戊巴比妥钠( 30 mg/ kg ) 静脉注射麻醉下， 取左上腹横切口， 暴露肝脏， 切开肝左叶被膜， 将2 块1 mm ×1 mm ×1 mm 瘤组织块植入肝实质内，10-0 无损伤线缝合肝被膜，7-0 丝线缝合腹膜， 5-0 丝线缝皮。
2. 术后，继续饲养， 逐日观察肿瘤生长情况。
六、传代
2. 术后，继续饲养， 逐日观察肿瘤生长情况。
六、传代
1. 当荷瘤裸鼠处于濒死状态时，取其中一只荷瘤裸鼠用颈椎脱位术处死， 系统解剖，取出移植瘤。
2. 取出的移植瘤一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代， 每次传代裸鼠5~10 只不等； 另一部分瘤组织液氮冻存备用，并被用做相关指标检测。
3. 其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡，以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。
8. 统计学处理
差异显著性采用t 检验, 数据以以x±s 表示，在SPSS10. 0 统计软件上完成。
2. 取出的移植瘤一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代， 每次传代裸鼠5~10 只不等； 另一部分瘤组织液氮冻存备用，并被用做相关指标检测。
3. 其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡，以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。
七、 观察项目
1. 解剖学和组织学检查
（1）全部被处死和自然死亡的荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查， 并记录肝内肿瘤，皮下移植瘤生长情况。
（2）淋巴结取材包括：髂动脉旁、髂动脉间、纵隔、肠系膜、幽门、贲门和肝门淋巴结等； 肺、肝、脾、肾、脑等器官常规取材，所有组织均经10% 中性甲醛固定， 石蜡切片，苏木精、伊红( H E) 染色， 光镜观察。
2. 免疫组织化学染色
采用LSAB 法，对全部裸鼠肝肿瘤切片用CD3、CD7、CD19、CD20、CD45RO、CD79a 抗体进行免疫组织化学染色，所用试剂均购自DaKo 公司。
（1）全部被处死和自然死亡的荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查， 并记录肝内肿瘤，皮下移植瘤生长情况。
（2）淋巴结取材包括：髂动脉旁、髂动脉间、纵隔、肠系膜、幽门、贲门和肝门淋巴结等； 肺、肝、脾、肾、脑等器官常规取材，所有组织均经10% 中性甲醛固定， 石蜡切片，苏木精、伊红( H E) 染色， 光镜观察。
2. 免疫组织化学染色
采用LSAB 法，对全部裸鼠肝肿瘤切片用CD3、CD7、CD19、CD20、CD45RO、CD79a 抗体进行免疫组织化学染色，所用试剂均购自DaKo 公司。
3. 电镜观察
移植瘤组织以2. 5% 戊二醛和1% 锇酸双固定， Epon-812 包埋， 超薄切片，铀- 铅染色，PHILIPS-CM10透射电镜观察。
移植瘤组织以2. 5% 戊二醛和1% 锇酸双固定， Epon-812 包埋， 超薄切片，铀- 铅染色，PHILIPS-CM10透射电镜观察。
4. 实验室检查
AFP 放免法； 乙肝标志：HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAgELISA 法； LDH-L 法。
AFP 放免法； 乙肝标志：HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAgELISA 法； LDH-L 法。
5. 流式细胞分析
采用美国FACS-420型流式细胞仪， 对正常肝细胞、瘤源标本、移植瘤细胞进行DNA 含量测定。
采用美国FACS-420型流式细胞仪， 对正常肝细胞、瘤源标本、移植瘤细胞进行DNA 含量测定。
6. 染色体检查
采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，收获细胞常规制片，GTG 法染色，显微镜下观察。
采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，收获细胞常规制片，GTG 法染色，显微镜下观察。
7. 恶性淋巴瘤组织学分类标准
采用2001 年新的WHO 分类方法。
采用2001 年新的WHO 分类方法。
8. 统计学处理
差异显著性采用t 检验, 数据以以x±s 表示，在SPSS10. 0 统计软件上完成。
其它（讨论）：
MLL 占非霍奇金淋巴瘤的0. 016%，是一种少见的恶性肿瘤， 有关MLL 的病因学和发病机制至今尚未阐明，临床上起病隐匿， 症状、体征和辅助检查均缺乏特异性， 且与原发性肝癌或肝转移肿瘤相混淆，诊断困难，术前确诊率低，误诊率高，预后很差。因此， MLL 基础和临床研究都要求建立一个理想的、可供研究的人肝原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型。经国际联机检索，有关人肝原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的建立在国内外迄今尚未见类似报道。本研究采用组织学完整的人肝恶性淋巴瘤新鲜组织块原位移植于裸鼠，首次成功地建立了一株肿瘤完全局限于肝脏的人肝恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HLBL-0102。对研究MLL 的生物学特性 、组织发生、 实验治疗、 肿瘤免疫、分子生物学都具有重要价值。在目前可供研究的MLL 组织标本不易获得的情况下， 本模型的成功建立为系统开展MLL 的诊断、手术、放疗、化疗、靶向基因治疗和药物筛选等前瞻性实验治疗创造了有利条件。同时， 也为MLL 基础理论的研究提供了同一人体来源，稳定传代，容易重复的新鲜瘤组织标本和动物模型。
人肝原发性淋巴瘤原位移植裸鼠后， 能否始终保持原有的生物学特征是模型建成的关键。我们所建立的HLBL-0102 已传至37 代，在裸鼠体内生长3 年，不仅移植瘤的组织病理学， 免疫组化表型，超微结构， DNA 倍体水平和染色体特点与来源MLL 细胞完全一致。而且肿瘤的移植生长率， 液氮冻存复苏成活率均为100%。移植瘤无自发消退， 总是按照潜伏期， 缓慢生长期和快速生长期的规律进行增殖，宿主的生存时间比较接近死亡前总是呈恶液质状态，这表明该模型的生物学特性是稳定的。
值得提出的是，移植瘤在宿主体内以类似于MLL 患者的方式展示其恶性行为。我们发现HLBL-0102 移植瘤完全局限于肝脏，肝呈多个结节肿大，切面散布着无数白色瘤结节，结节间有融合型实质瘤块，结节间可见残存的肝组织，严重时肝组织有瘤结节替代。无其他组织和器官侵犯及远处淋巴结的累及， 完全符合MLL 诊断的标准。实验中还发现HLBL-0102 完整的模拟了人MLL的体内表现：在MLL 患者体内发现的外周血AFP 阴性，HBsAg 及HBeAg 阳性，乳酸脱氢酶升高等均见于裸鼠原位移植瘤在裸鼠体内。而且LDH 水平随着荷瘤裸鼠生长期的延长， 肿瘤增大而显著增高。这说明了HLBL-0102 和HBLB-0103 这两株模型虽然在裸鼠体内长期传代仍保留人MLL 分泌LDH 的功能。HBsAg 检测结果提示人肝恶性淋巴瘤在移植裸鼠后仍保持原来阳性特点。且作者观察到瘤细胞弥漫地浸润肝脏，破坏汇管区、胆小管及肝小叶结构破坏和瘤灶周边汇管区可见大量成熟的淋巴细胞浸润。本实验也证实了Maher 等提出MLL 的组织发生起源于肝脏汇管区内的淋巴细胞和慢性肝炎病毒的持续刺激在MLL 的组织发生中起着重要作用。LDH 升高是诊断MLL 并判断预后的敏感指标。这些结果表明HLBL-0102 完整的重现了MLL 临床病理学特征及临床生物学行为。
综上所述， 所建立的人肝原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型出现高的肿瘤移植生长率和肝内出现广泛播散的原因为： ( 1) 肿瘤细胞本身的高侵袭恶性潜能； ( 2) 与移植部位微环境因素有关、如肝的特殊结构、丰富的淋巴、血液循环、生化及免疫学特点等。正是由于裸鼠肝微环境与人肝相似， 使植入的肿瘤出现类似于人肝原发性恶性淋巴瘤体内的播散过程，为肝原发性恶性淋巴瘤的基础和临床研究提供了理想的动物模型平台。
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