实验方法
旷场实验、Morris水迷宫对大鼠情感行为及学习记忆的影响
旷场实验、morris水迷宫对大鼠情感行为及学习记忆的影响的研究已受到国内外学者的关注。临床研究发现早年反复热性惊厥发作和日后生一定联系;实验证实热性惊厥可导致未成熟脑海马区神经元变性坏死,细胞器及突触病理性超微结构变化。作者采用热水浴法建立热性惊厥大鼠模型,探讨热性惊厥对大鼠情感行为以及学习记忆能力的影响。
1 对象和方法
1 . 1 对象 21日龄雄性SD(Sp raque2Dawley)大鼠36只(西安交通大学医学院实验动物中心提供) ,体重为(50±5)g ;随机数字法均分为热性惊厥组(FS) 、发热对照组(F G) 、正常对照组(N G) ,每组大鼠数目均为12只;各组均于标准环境下饲养,自由进食饮水。
1 . 2 方法
1 . 2 . 1 建立热性惊厥模型 采用热水浴法建立热性惊厥大鼠模型:将FS组大鼠放入一透明玻璃筒中(直径10 cm ,高50 cm) ,该筒下部有多个小孔和外部相通;将筒竖放于恒温(45 . 0±0 . 25) ℃水浴箱(100 cm×70 cm×50 cm)中,通过向玻璃筒底垫放橡胶垫片以调节筒中水的高度,以大鼠沿筒壁站立时仅露出颈部以上为准;每只大鼠上、下午均用该方法诱发惊厥一次,连续5 d共10次;观察惊厥的发生并记录惊厥发生的潜伏期(大鼠入水至惊厥开始的时间间隔,记录单位为min) 、级别、持续时间(大鼠惊厥开始至惊厥结束的时间间隔,记录单位为秒) 。F G组大鼠以同样的方法在热水中浸浴2min而未发生惊厥。N G组不进行任何处理。惊厥级别参照W J iang等的标准: 0 级为未发生抽风;1级为面部抽动;2级为点头;3级挛抽搐;4级为全身强直;5级为全身强直阵挛。
1 . 2 . 2 旷场试验(open field test ,O F T) 型号：XR-XZ301（上海欣软信息科技有限公司研发）将一60 cm×60 cm×60 cm的无顶木盒底部等分为36个小方格,完成10次惊厥的大鼠放置于木盒底部的中央,记录5min内大鼠活动经过的格子数的得分、后肢性站立的次数以及排出粪便的粒数。记分标准为:大鼠1/ 2以上身体进入相邻方格记1分,后肢性站立记1分,合计为其总分。研究认为,经过的格子数的得分反映动物的兴奋性;后肢性站立的次数代表大鼠对陌生环境的适应能力; 排出粪便的粒数提示大鼠的紧张程度。
1 . 2 . 3 避暗试验(passive avoidance test , PAT) SF K2Ⅰ型避暗测试箱(日本产)分明、暗两室,其间有小门相通;避暗习性使大鼠本能地选择进入暗室,进入暗室的大鼠即刻遭受电击(3 mA ,50 Hz)而被动地逃回安全的明室。5 min不进入暗室则被认为完成了学习,记录遭受10次热性惊厥后大鼠在完成学习前错误地进入暗室的次数,主要反映大鼠近期学习的能力; 24 h后再次放回明室,记录大鼠由明室进入暗室的时间,即为记忆潜伏期,主要反映大鼠近期记忆的能力。
1 . 2 . 4 Morris水迷宫试验(Morris water maze test ,MWM T) Morris水迷宫型号：XR-XM101（上海欣软信息科技有限公司研发）由圆形水池(直径130 cm ,高50 cm) 、摄像头以及操作分析系统(微机及软件)组成。圆形水面被通过圆心的两条假想垂线划分为4个象限。试验前一天使大鼠在水池内自由游泳2 min ,以熟悉环境。试验时间共4 . 5 d ,在其中一个象限的正中水域内放置一个圆形透明站台(直径10 cm ,高28cm) ,站台隐于水面下2 cm处,水温保持于24℃左右。每天上、下午各进行4次试验,每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水1次,大鼠入水后尽力逃避水患,当发现站台后则栖身其上,图像采集系统及分析系统自动记录大鼠找到站台的潜伏期(escape latency) 。如果120秒仍未找到站台,由操作者将大鼠引上站台休息4秒,并将潜伏期记为120秒。每只大鼠上、下午4次成绩的均值作为一个时段值(sectio n , Ⅰ2Ⅸ)进行分析。旷场实验、Morris水迷宫对大鼠情感行为及学习记忆的影响
1 . 3 统计学处理 所有计量资料均以…x ±s 表示。依资料性质进行方差分析,检验水准为α= 0 . 05。
2 结 果
2 . 1 热性惊厥发生情况 FS组全部诱发出热性惊厥,共诱发惊厥120次,无1例死亡。5、4、3、2、1级惊厥次数(及百分比)分别为89(74 . 0 %) 、5(4 . 6 %) 、20(16 . 5 %) 、4(3 . 5 %) 、2(1 . 4 %)次;惊厥发生的潜伏期为(4 . 02±0 . 76)min ;惊厥持续时间为(1 . 01±0 . 53)min。
2 . 2 旷场试验中情感行为的改变 FS组大鼠穿格得分分值(37 . 48±7 . 09)最低,后肢性站立的次数(12 . 11±4 . 41)最少, 5 min 内排出的粪便粒数(10 . 62±2 .32)最多; FS组与N G、F G组相比在穿格得分(q= 4 .72 ,4 . 18 ;P< 0 . 01) 、后肢性站立的次数(q= 5 . 12 ,4 .85 ;P< 0 . 01)以及排出粪便粒数(q= 5 . 33 ,5 . 02 ;P<0 . 01)等方面的差异有非常显著性。此外,在排出粪便粒数方面,N G、F G组差异亦有非常显著性(q= 3 . 17 ,P< 0 . 05) 。
2 . 3 避暗试验中学习记忆的变化 FS组大鼠在达到学会程度时所犯错误次数(4 . 02±1 . 29)最多,同N G、F G组相比差异有非常显著性( q= 6 . 2 4 , 5 . 3 1 ;P<0 . 01) 。24 h后FS组大鼠的记忆潜伏期(169 . 71±103 . 22)最短,同N G、F G组相比差异有非常显著(q= 5 . 69 ,5 . 28 ;P< 0 . 01) 。结果表明反复热性惊厥发作可以损害大鼠短期学习记忆能力。
2 . 4 Morris水迷宫试验中空间学习能力的变化 FS组大鼠在Morris水迷宫中寻找隐匿站台的能力,表现为逃逸潜伏期显著延长,提示反复热性惊厥发作可损害大鼠空间学习能力;方差分析表明FS组同N G、F G组在逃逸潜伏期方面差异有非常显著性( F= 152 . 46 ,P< 0 . 01)
3 讨 论
热性惊厥是儿科最常见的急症之一,因发作时临床表现突然、剧烈而对家庭成员及社会造成不良影响。热性惊厥能否对患儿日后情感行为以及学习记忆造成损害已引起学者的关注。
3 . 1 本热性惊厥动物模型的科学性 本实验采用热水浴法建立热性惊厥模型并对实验器具加以改造,使热性惊厥组大鼠全部诱发不同级别的惊厥,既往文献报道大鼠易溺死的情况得以改善。实验器具(底部带空的玻璃圆筒)的改善也使大鼠的粪便不易排到水浴箱中,从而保证了实验操作过程的整洁卫生。同其他模型相比建立热性惊厥模型是一种理想的实验方法。
3 . 2 热性惊厥对情感行为及学习记忆的影响 本实验发现FS组大鼠在旷场试验中的兴奋性下降,适应新环境的能力降低,同时易于发生紧张的不良反应;避暗试验结果表明反复热性惊厥发作可以降低大鼠的短时学习记忆能力。Morris水迷宫是由英国心理学家Morris设计的用以反映小型啮齿动物空间学习记忆能力的理想装置,可用以疾病或应激对人类学习记忆能力损害的比拟性研究。FS组大鼠在Morris水迷宫中逃逸潜伏期显著延长,反映大鼠空间学习能力受损。以上结果表明,反复热性惊厥发作可导致大鼠的情感行为以及学习记忆能力受损,和以往的研究相似。
3 . 3 热性惊厥影响情感行为及学习记忆的可能机制反复热性惊厥发作导致大鼠情感行为以及学习记忆能力受损的机制不明。既往研究发现反复热性惊厥发作可导致脑海马区结构发生病理变化,包括海马区神经元变性坏死、突触形态学改变(突触间隙异常增宽)、海 马 区 异 常 苔 藓 样 纤 维 发 芽(mossy fibresp routing),以及由此所导致的突触联系异常、与学习记忆关系密切的NMDA(N2甲基2D天冬氨酸)受体分布表达异常和信号转导通路异常。而海马结构是属于古皮质,是边缘系统的重要组成部分。海马与丘脑前核群、板内核群、下丘脑乳头丘脑束、扣带等结构组成的环路是调节行为、学习记忆以及情绪反应的重要神经解剖学基础。因而上述有关海马结构功能改变的发现可能是解释反复热性惊厥发作导致大鼠情感行为以及学习记忆能力受损的重要内容。但这些过程之间的关系以及每个过程对脑功能受损的影响程度尚待进一步深入研究。
