实验方法
Morris水迷宫对卵巢切除大鼠学习与记忆的影响
Morris水迷宫实验主要测定空间学习记忆能力，主要的实验内容有隐蔽站台试验、空间探索试验、反向试验和可视站台试验等。在这里主要介绍下文献里面主要做的隐蔽站台试验和空间探索试验的流程准则。
啮齿类动物第一次游泳时,一般不会找到藏于水面下的不可见的站台。若动物在入水游泳60～90s以内仍未能找到水池中的站台或未能爬上站台时,实验人员可将动物引导置于站台上站立10～30s,使动物体会站在站台上的感觉,这样从第二次开始,学习成绩就能迅速提高。动物爬上站台后,让动物在站台上站立5～10s。将大鼠从站台上拿下来,休息30～60s以后再进行下一次训练。在一般情况下,正常大鼠在经过4～6个实验日训练后,很快就学会以最快最佳的轨迹搜索到站台的确切位置。
每天开始时，将鼠任意从四个象限（东北、西北、东南、西南）之一面向池壁放入水中，站台放置于东南象限， 每次实验鼠共游泳60～90s来寻找隐藏的站台。如果成功地找到站台，鼠可以得到在站台上的10～30s休息时间；如果60～90s内未能成功的找到站台，就由实验人员将鼠人工置于站台上，且同样给予10～30s的休息时间。有时鼠可能会在10～30s间隔时间到达之前从站台上掉下或跳入水中继续游泳。一旦这种情况发生，则将鼠重新放回站台，并重新计时，使时间间隔到达（10～30s）。这样可以确保每只鼠在每次实验后有相等的时间来观察和获取空间信息。
1 材料和方法
1. 1 材料 ①动物 : 雌性 SD 大鼠 40 只 ( 第四军医大学实验动物中心) , 体质量 180 ～200 g. 饲养温度22 ℃,12 h 光照 ,12 h 黑暗 ,允许自由饮水和摄食 ; ②药物 : 17 β 2 雌二醇 ( 17 2 βestradiol , E2) : 美国 Sigma 公司生产 ; GST :第四军医大学药物研究所 , 药品批号 :20010110. 乙酰胆碱脂酶 ( Ache) 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供. 其他试剂为国产分析纯试剂.Morris水迷宫仪器，XR-XM101型，上海欣软信息科技有限公司提供。SuperMaze动物行为学分析软件，由上海欣软信息科技有限公司提供。
1 . 2 方法
1 . 2. 1 动物分组制模 随机分为 5 组 ,每组 8 只 : 假去势组 ( Sham 组) ; 去势组 ( 卵巢切除术组 , ovariecto2my , OVX) ; OVX + E 2 组 ; GST 高剂量组 ( OVX +GST 2 h) ; GST 低剂量两组 ( OVX + GST 2 L ) . 适应性饲养 5 d 后开始实验. 全部大鼠在速眠新 ( 0. 3～0. 8mL/ kg) 腹腔注射麻醉下行手术 , 假去势组在开腹后去除卵巢周围的脂肪组织后关腹 ; 其余各组行双侧OVX.
1. 2. 2 给药方法 术后 1 wk 开始灌胃给药. 根据每日药物处理剂量分为 5 组 : 假去势组 ( Sham 组 , 生理盐水 5 mL/ kg) ,OVX 组 (生理盐水 5 mL/ kg) ,OVX+ E 2 组(400μ g/ d , E 2) ,OVX + GST 2h 组(50 mg/ kg) ,OVX + GST 2 L 组(25 mg/ kg) . 连续用药 5 wk.
1 . 3 行为学测试
1 . 3. 1 实验条件与仪器 水迷宫材质采用ABS工程塑料（汽车、飞机外壳材质）模具制作，水池上空通过一摄像机和计算机相连接. 水池直径约160cm ,深约 50cm ,预先在水池内注入清水 , 然后加入少许墨汁 ,使水变成不透明的灰色 , 再注入清水使水面高出平台 2 cm ,水温控制在 22 ℃ . 以沿水池边缘相等分布的 4 个点作为起始点 ,这样水池被分为 4个相同的象限 ( 四分之一圆) ,平台位于某个象限的中间 ,在其他 3 个象限任选一个入水点. 实验每日 2次 ,第 2 日的入水点与前一日采用不同的入水点 , 每次训练 120 s. 若大鼠在 120 s 内尚未找到平台 ,则将大鼠拿到平台上并使它在上面停留 30 s ; 若大鼠在120 s 内找到平台 ,也让其在平台上停留 30 s ,这样才结束一次训练. 采用上海欣软信息科技有限公司研制的 Morris 水迷宫检测软件系统自动跟踪池内大鼠的活动轨迹并记录大鼠游泳时间、游泳速度及游泳距离等参数.
1. 3. 2 结果评价 当测试软件设定的训练时间已到或大鼠已经爬上平台 ,计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出大鼠在水池中所游过的路程 ,找到平台时所需的时间即潜伏期. 我们以大鼠入水后找到平台的游泳时间即逃避潜伏期 ( escape latency ,EL ) ,作为观测指标. 120 s 内未找到平台的记为 120s. 连续训练 5 d ,第 6 日撤除平台 , 进行空间探索实验 ,在原平台象限的对侧象限入水 ,记录游泳轨迹.
1. 4 Ache 活性测定
1. 4. 1 组织样本的处理 大鼠结束 Morris 水迷宫试验后次日断头处死 ,在冰浴上迅速剥离大脑皮层和海马 ,准确称取皮层和海马 ,加入预冷的生理盐水 ,在冰浴中用匀浆器将脑组织匀浆 , 制成 10 g/ L 的组织匀浆 ,组织匀浆经 4000 r/ min , 4 ℃离心 20 min ,取上清液 ,移入 E ppendorf 管 , - 70 ℃保存待测.
1. 4. 2 Ache 的活性测定 参照试剂盒提供的试剂及方法进行操作. 应用 722 型紫外线分光光度仪.
1. 4. 3 蛋白测定 采用 Bradfordf 法.统计学处理 数据用 x ± s 表示 ,采用 SPSS 10. 0软件进行统计分析 ,所用统计方法为单因素方差分析及重复测量资料方差分析.
2 结果
2 . 1 去除卵巢对大鼠空间学习记忆的影响及 GST和雌激素的作用
2. 1. 1 各组大鼠 5 d 训练中潜伏期的变化 各实验组随着训练次数的增加 ,每组平均逃避潜伏期在不断缩短 , 但各实验组间的逃避潜伏期无显著性差异( P > 0. 05 , Tab 1) .
2. 1. 2 空间探索实验结果 撤除平台后 , 大鼠在原平台象限的对侧象限入水 , 记录 120 s 的游泳轨迹 ,分析大鼠在原平台象限的记忆频度及找到原平台位置的游泳时间既逃避潜伏期 ,以此反映大鼠的空间记忆能力. 从 Tab 2 中可以看出 ,撤除平台后 ,OVX 组大鼠游泳逃避潜伏期较 Sham 组较明显延长 ( P <0. 05) ,其记忆频度也较 Sham 组降低 ( P < 0. 05) ; 雌激素组逃避潜伏期及记忆频度较 OVX 组有显著的变化 ; GST 组逃避潜伏期也较 OVX 组缩短 , 而记忆频度也明显增加 ( GST 2 L 组 , P < 0. 05) .
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总结：探讨Morris水迷宫对卵巢切除大鼠认知功能的影响及可能的机制. 方法: 选用成年雌性SD大鼠40只,随机分为假去势组(Sham)、去势组(卵巢切除术,ovariectomy, OVX)、雌二醇组(OVX+E2)、GST高剂量组(GST-h)及GST低剂量组(GST-L),每组8只. 采用Morris水迷宫方法观察去卵巢大鼠学习记忆的改变及GST和E2对其改善作用,用比色法测定了大鼠前脑皮层和海马中乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase, Ache)的活性,观察了药物对此酶活性的影响. 结果: OVX后7 wk大鼠出现学习记忆障碍,表现为OVX组逃避潜伏期较Sham组明显延长(88.9±35.1) s vs (51.7±36.9) s, P<0.05,记忆频度下降(18.7±2.7) vs (24.9±4.5), P<0.05;前脑皮层、海马的Ache活性升高(286.7±27.8) μkat/L vs (245.6±36.1) μkat/L, (363.9±46.1) μkat/L vs (275.8±52.8) μkat/L, P<0.05, P<0.01. 用药后,E2组逃避潜伏期及记忆频度较OVX组有明显改变(57.3±21.7) s vs (88.9±35.1) s, (25.5±5.4) vs (18.7±2.7), P<0.05, P<0.01; GST-L组记忆频度也较OVX组增加(22.7±2.0) vs (18.7±2.7), P<0.05;GST及E2能降低因OVX造成的大鼠前脑皮层和海马中Ache的活性的升高(P<0.01). 结论: GST和E2有改善因OVX造成的大鼠学习记忆减退作用,其可能的机制是抑制了脑内Ache的活性,使乙酰胆碱的降解减少. |
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