实验方法
开场行为对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆能力的影响
摘要 : 用 D- 半乳糖 (D- gal) 建立衰老动物模型且海马内微注射β AP ,检测各组大鼠开场行为、 Y- 迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化的方法 ,研究β - 淀粉样蛋白 ( β AP) 对衰老大鼠开场行为及学习记忆能力的影响. 结果是 D- gal + NS 组、 D- gal + β AP 组大鼠在新异环境中自发活动和探究行为减少 ,学习记忆减退 ,与NS + NS 组比较有显著性差异 ( P < 0. 05 , P < 0. 01) . 该文得出的结论是β AP 与 D- gal 联合使用可导致脑老化程度加重 ,学习记忆能力显著减弱.
关键词 : β - 淀粉样蛋白 ; 开场行为 ; 学习记忆 ; 衰老
β - 淀粉样蛋白 ( β - amyloid protein , β AP) 是老年性痴呆患者的大脑中特有的一种蛋白 , 它在老年性痴呆的发病机理中的作用已引起人们的重视. 生化研究表明 ,β - 淀粉样蛋白是老年性痴呆患者脑海马和皮层老年斑 ( SP) 的主要成分 , 它与 AD 的病理形成过程关系密切. 已有报道 β AP 对正常大鼠海马神经元的毒害作用, 但有关β AP 对衰老大鼠的作用 ,国内外均未见报道 , 本实验试图在 D- 半乳糖所致衰老动物模型基础上进行海马内注射β AP ,观察其对大鼠开场行为和空间分辨学习以及记忆保持能力的影响.
1 材料与方法
1. 1 动物和试剂
雄性健康 SD 大鼠 ,体重 100～120 g ( 江苏省实验动物中心提供) , β AP 为 Sigma 公司产品 ( β AP1 -40 ,Lot NO. 76 H49611) ,D- 半乳糖 ( D- gal) 为上海试剂二厂产品.
1. 2 分组和模型建立
将大鼠随机分成 4 组 : ①生理盐水 NS + NS组 ; ② NS + β AP 组 ; ③ D- gal + NS 组 ; ④ D- gal + β AP组. ③、④组动物腹腔注射 D- 半乳糖 :50 mg· kg- 1·d- 1,连续注射 6 周建立衰老动物模型; ①、②组动物腹腔注射等量生理盐水. 于第 4 周进行双侧海
马内注射β AP , 每侧注射 1μ L ( 4μ g/μ L ) ; 对照组注射等量生理盐水. 海马定位注射方法 : 大鼠腹腔注射 4 %戊巴比妥钠 ( 40 mg. kg- 1) 麻醉 , 立体定位仪( 日本 NARISHI GE SN - 3 型) 上固定 , 坐标按照图谱, 以前囱定位 : AP = - 3. 5 mm , ML = ± 2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,钻开颅骨 , 用微量进样器垂直进针 ,每侧注射时间为 5min ,留针 5min ,缓慢起针 , 局部消毒后缝合皮肤 ,肌注抗生素抗感染.
1. 3 行为学检测
连续腹腔内注射 6 周后进行.
1. 3. 1 开场行为 (open field):
将动物置于圆形开场检测箱底中央的格内 , 记录其在 3 min 跑动 (locomotion) 穿过的格数 ,后肢站立 ( rearing) 次数、梳理 ( groo ming) 次数及粪便颗粒数. 比较不同组间大鼠在新异环境中自发行为和探究行为表现的差异.
1. 3. 2 Y - 迷宫分辨学习 ( Y- maze discri minationlearning) 能力检测:
Y- 迷宫为三等分辐射式反射箱. 以大鼠被电击后逃至安全区为一次正确反应 ,连续 10 次测试中有9 次 ( 90 %) 正确反应 , 定为学会标准. 记录每个大鼠达到学会标准的训练次数. 所有检测过程均由计算机完成.
1. 3. 3 一次性被动回避反应 ( one- trial passiveavoidance res ponse):
根据大鼠趋暗习性 , 记录其在通道上的停留时间 ,即步入潜伏期 ( step- through latency , STL ) ; 动物进入暗箱后立即给予电击 ( 0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后检测大鼠的 STL . 以 STL 作为记忆保持的指标 ,STL越长表明对电击的记忆保持越好. 检测以 240 s 为限.
本实验数据用 ( X ±S? X( X 表示 , 组间差异用 t检验 ; 一次性被动回避反应采用 Mann- whitney 非参数检验.
2 结 果
2. 1 不同组大鼠开场行为观察
统计处理表明 ,在开场行为诸参数中 ,D- gal + β AP 组动物与 NS + NS 组比较粪便颗粒数有显著性差异 ( P < 0. 05) , 而跑动格数则极明显减少 ( P < 0. 01) , 前者在新异环境中自发活动和探究反应明显下降 ,紧张恐惧状态也降低. D- gal + NS组动物跑动格数与 NS + NS 组比较也有显著性差异 ( P < 0. 05) . NS + NS 组与 NS + β AP 组之间虽无
显著性差异 , 但其跑动格数、站立次数均有下降趋势 ,说明β AP 单独使用对大鼠在新异环境中的自发活动及探究行为也有一定影响.
2. 2 Y- 迷宫分辨学习能力检测
达到学会标准所需训练的次数 , NS + NS 组 :21. 4 ± 2. 6 ;NS + β AP 组 :34. 6 ± 5. 5 ;D- gal + NS 组 :42. 4 ± 5. 4 ;D- gal + β AP 组 :48. 0 ± 5. 6. 前两者比较无显著性差异 ( P > 0. 05) ,D- gal + NS 组与 NS + NS组比较有显著性差异 ( P < 0. 05) , 而 D- gal + β PA 组与 NS + NS 组比较 ,达到学会标准所需训练次数极明显增加 ( P < 0. 01) ,说明 D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨学习能力显著降低 , 而在衰老动物模型上海马内注射β AP 更使学习能力极显著下降.
2. 3 一次性被动回避反应
D- gal + β AP 组记忆保持能力明显下降 ,电击后 24 hSTL 显著缩短 , 与 NS + NS 组和D- gal + NS 组比较有显著性差异 ( P < 0. 05) . 其他组之间比较 ,差异无显著性 ,但记忆保持能力呈逐渐降低趋势.
3 讨 论
有研究报道 ,对大鼠连续注射 D- 半乳糖引起拟衰老效应, 可导致动物学习记忆能力下降 , 脑内超氧阴离子自由基水平增高 , 超氧化物歧化酶( SOD) 活性降低 , 丙二醛和脂褐素含量升高. 这说明 D- 半乳糖诱发的自由基蓄积引起的脂质过氧化损伤 ,是产生拟衰老变化的原因 ,这必然也会引起衰老性脑功能的衰退.β AP 是老年性痴呆患者最早出现的典型的病理学特征. 一些学者认为 , β AP 可引起学习记忆减退、认知障碍等,是 AD 各种病理和临床表现的始发因素. β AP 具有沉积作用和神经毒性 , 较高浓度的β AP 能引起神经退化和死亡; β AP 的神经毒性作用可以增强或加大各种伤害性刺激的细胞损伤效应 ,此外它还具有直接的细胞毒性. 但 Morimoto报道 ,在大鼠海马神经元 , 单独注射β AP 不能产生特定的神经毒性作用 , 仅能引起少量的神经元变性. 无论在体外培养细胞 , 还是在体内研究中 ,β AP 是否具有神经毒性作用还存在着争议 , 其原因可能是所用β AP 的浓度不同所致. 本研究结果表明海马内单独注射β AP 不能引起明显的行为学变化 ,但在衰老动物模型基础上经β AP 处理后 , 可导致动物自发活动及学习记忆行为明显降低 , 说明D- 半乳糖和 β AP 有叠加效应. 学习记忆是脑的高级功能 ,学习记忆减退是脑功能衰退的表现. 因此 ,本实验结果提示 , 在 D- 半乳糖所致衰老动物基础上 ,海马内注射β AP ,可望作为更接近 AD 的一种动物模型. 但它是否具有 AD 的各种病理学特征 , 还有待于做进一步研究.
来源：上海欣软信息科技有限公司
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