实验方法
大鼠癫痫模型的建立
目的:用氯化锂—匹鲁卡品制备Wistar 大鼠癫痫模型,探讨匹鲁卡品合适的用量及用法。方法: Wistar 大鼠腹腔注射氯化锂3mmol /kg , 24h 后,给予不同剂量的匹鲁卡品腹腔注射。结果:40mg/ kg 组和30mg/ kg 一次注入组的持续性癫痫大发作(SE) 出现率和亡率均为100% , 慢性复发性癫痫(SRS) 模型成功率为0%; 30mg/kg 分3 次注入组SE 出现率为28% ,死亡率为10% ,SRS 成功率为18%;25 mg / kg 3 次注入组SE 出现率为10% ,死亡率为0% ,SRS 成功率为10%。结论: 用氯化锂—匹鲁卡品制备Wistar 大鼠癫痫模型,鲁卡品的用量应为25～30mg/ kg ,分次注入法优于单次注入法。
癫痫为一常见病,由于其发作没有预见性,发作的程度也不能人为控制,从而给研究带来困难,因此建立实验性动物癫痫模型, 对于探索癫痫的发生机制,筛选、评价抗癫痫药物的作用,具有重要意义。
动物癫痫模型的制备有很多种方法, 文献报道氯化锂—匹鲁卡品注射所致的大鼠癫痫持续状态(SE) , 时间达到1 h 并且存活者, 即为自发作性癫痫(SRS) 模型[1 ,2 ] ,这种癫痫模型类似于成年人癫痫中最常见的类型, 即颞叶癫痫, 并且具有操作简单、重复性好、受外界干扰小等优点。本实验用氯化锂—匹鲁卡品制备Wistar 大鼠癫痫模型,探讨匹鲁卡品的具体剂量及用法。
1 材料与方法
1. 1 实验动物与分组 健康雌性Wistar 大鼠,体重210～260g , 购于中国医学科学院实验动物繁育中心,在室温、自然光环境下给予充足的食物及水。按匹鲁卡品注射剂量分为40mg / kg 一次注入组( 6只) 、40mg/ kg 分3 次注入组(4 只) 、30mg/ kg 一次注入组(5 只) 、30mg/ kg 分3 次注入组(50 只) 、25mg/ kg 分3 次注入组(10 只) 。
1. 2 癫痫模型的制备 所有大鼠均于实验前24h时腹腔注射氯化锂3mmol / kg , (浓度为1. 5mol / L ) [3 ]。24h 后, 给予不同剂量的匹鲁卡品腹腔注射(浓度为0. 1%) 。分次注入组每次注射时间相隔10min [4 ]。凡出现持续性癫痫发作(SE) , 并持续至1h 者, 给予安定10 mg/ kg 腹腔注射予以终止[2 ]。
2 结果
2. 1 各剂量组不同表现统计 所有大鼠均于第一次注射匹鲁卡品后5～10min 出现胆碱能周围神经刺激症状, 即竖毛、流涎、血泪症, 并出现不同程度的以下表现, 包括: 少动、盯视、嘴部自动症、点头、眨眼、湿狗样晃动; 33 只大鼠出现瞬时性癫痫大发作: 表现为直立、前肢和头部阵挛、摔倒, 瞬时性癫痫大发作开始于第一次注射30min 之后,每次持续30～45s , 之后每隔2～5min 再次发作; 30 只大鼠出现持续性癫痫大发作(1h) , 表现与瞬时性癫痫大发作相同; 20只大鼠在持续性癫痫大发作后1～2天死亡; 10只SE 发作后存活者, 均于20～60 天出现自发性癫痫发作, 表现为耳抖、咀嚼、盯视等动作,每次持续数秒至数十秒,见表1。
2. 2 癫痫模型成功组的比较 见表2
25mg/ kg3次注入组与30mg / kg 3 次注入组SRS 成功率统计学分析(统计学方法为χ2 检验,χ2 = 0. 38) : P > 0. 05 , 即上述两种方法无统计学差异。
上述结果显示, 用氯化锂—匹鲁卡品制备Wistar 大鼠癫痫模型, 匹鲁卡品的总量应为25～30mg/ kg , 剂量为40mg/ kg 均可出现SE , 但死亡率极高;总量在30mg / kg 时,一次注入时死亡率较高, 应当分次注入, 可根据鼠的不同表现酌情增减,以适应不同的个体差异。
3 讨论
用氯化锂—匹鲁卡品腹腔注射制备的Wistar大鼠癫痫模型具备Racine 所述5 级行为表现[5 ] ,即: I 嘴和面部抽动; I I 头部阵挛性运动; I I I 前肢阵挛; IV 阵挛性直立; V 姿势控制丧失(摔倒) 。其中I～ I I I 级行为代表复杂部分性发作, IV～ V 级行为代表了继发全身性发作。此模型较好地模拟了人类癫痫发生、扩布和形成的全过程,是唯一与临床最常见的成年人癫痫病, 即颞叶癫痫的特征相一致的动物模型[6 ] : 并且有操作容易、重复性好的优点, 是癫痫发生、形成机理研究较理想的模型。
用氯化锂—匹鲁卡品制备Wistar 大鼠癫痫模型, 文献报道匹鲁卡品单次注入30mg/ kg , 可使70%大鼠发作SE , 但尽管SE 持续90min 时用安定终止,仍有45%死亡;匹鲁卡品30mg/ kg 分次注射,发作SE 后死亡率降至10 %以下,并且低剂量重复注射后, SRS 的几率大于大剂量单次注射的几率[7 ] ,因此,小剂量分次注射的方法优于大剂量单次注射。本实验的结果与文献报道一致。
与文献报道相比较, 本实验的癫痫模型成功率低,而死亡率高,其可能原因为:本实验均为雌性鼠,而文献多为雄性鼠[1 , 2 , 6 ] , 不同性别鼠对匹鲁卡品的易感性不同; 文献报道胆碱能神经元在大鼠出生后2 周开始发挥作用,4 周时乙酰转移酶达成年大鼠的83% ,因此,大鼠对匹鲁卡品产生癫痫的敏感性具有年龄依赖性[8 ] ,鼠龄为3 周时死亡率最高,成年大鼠的死亡率又有所下降,本实验所采用者为成年鼠,但较文献报道者略小(以上实验鼠体重为210～260g ,文献多为250～300g) ,可能是原因之一; 阿托品可拮抗匹鲁卡品致痫及对脑组织的损害作用, 本实验未予阿托品,也是原因之一。
参考文献:
[1] Cavalheiro EA , Leite J P , Bortolot to ZA , et al . Long —term effects of pilocarpine in rats structural damage of the brain triggers kindling and spontaneous recurrent seizures [J ] .Epilepsia ,1991 ,32 :778
[2] Hort J , Brozek G , Mares P , et al . Cognitive functions after pilocarpine —induced status epilepticus : changes during silentperiod precede appearance of spontaneous recurrent seizures[J ]. Epilepsia ,1999 ,40 :1177
[3] Michael P , Honchar JW , Olney WR ,et al . Systimic cholinergicagents induce seizures and brain damage in lithium - treated rats[J ] . Science , 1983 , 220 :323
[4] Glien M , Brandt C , Pot schka H , et al . Repeated low-dose treatment of rats with pilocarpine : low mortality but highproportion of rats developing epilepsy[J ] . Epilepsy Res , 2001 ,46 :111
[5] Sato M , Racine RJ , Mc Intyre DC. Kindling : basic mechanisms and clinical validity[J ] . Electroencephalography and clinical Neurophysiology ,1990 ,76 :459
[6] Cavalheiro EA , Santos NF , Priel MR. The pilocarpine model of epilepsy in mice [J ] . Epilepsia ,1996 ,37 :1015
[7] Jope RS , Morriset t RA , Snead OC. Characterization of lithium potentiation of pilocarpine-induced status epilepticus in rats[J ] . Exp Neurol ,1986 ,91 :471
[8] Isokawa M. Remodeling dendritic spines of dentate granule cells in temporal lobe epilepsy patients and the rat pilocarpine model [J ] . Epilepsia ,2000 ,41 :S14
