结核病是人畜共患慢性传染病，在世界范围内具有高致病性和致死性，由结核分枝杆菌引起[1]。通过患者痰液进行痰涂片及痰培养可以用于检测结核病，涂片虽简单易行，但是阳性率低，培养虽然是金标准，但周期太长，均难以满足临床需要[2]。通过常规皮内变态反应                                                               

 

(TST)仍然是最佳最快的临床结核筛查、诊断方法。结核皮内变态反应诊断试剂的研发仍然是目前的难点，其一就是用于研发的动物模型较少。豚鼠对结核分枝杆菌高度敏感，其感染后的病理改变与人类相似，造模方便且存活率高，是公认的结核病实验动物模型。豚鼠迟发型超敏反应非常强烈，已经广泛应用于抗结核药物和相关生物制剂检测中，成为人类结核菌素皮肤试验效能和结核检测生物制品鉴定效价的金标准[3,4,5]。本研究旨在探索不同浓度灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，通过标准PPD皮试，观察迟发型致敏反应（DTH），获得最佳致敏豚鼠时灭活H37Rv全菌体的浓度，及观察致敏对豚鼠动物福利的影响，如体重、注射部位的影响。

1 材料及方法

1.1 注射菌液制备

H37Rv菌株用Middlebrook 7H11 培养基培养21天，收集菌体，PBS洗3次，115℃，10lb灭活30分钟，干燥，放于4℃冰箱备用。称取灭活H37Rv全菌体，加入注射用生理盐水和等量弗氏不完全佐剂，研磨均匀乳化至滴入清水不散开。

1.3 实验动物

SPF级Hartley豚鼠，35~45日龄，广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2008-0002。动物饲养于屏障动物实验室，实验动物使用许可证编号：SYXK（粤）2012-0122。

1.4 致敏和激发

豚鼠检疫适应7天后，每只豚鼠大腿内侧腹股沟皮下注射相应浓度灭活H37Rv全菌体，分3个位点注射进行致敏，共注射0.5mL。

致敏后不同时间段进行激发，取已经致敏的豚鼠，背部剃毛，皮内注射0.1mL PPD（5IU），每只豚鼠注射相同部位。

1.5 观察指标

致敏后连续称取豚鼠体重5次，每周1次，制作体重生长曲线；观察腹股沟皮下注射部位溃烂情况。激发后24h、48h各观察豚鼠1次，测量、记录皮试红斑硬结的纵、横直径并计算其均值。 

1.6 统计分析

    对豚鼠致敏激发结果进行统计处理并列表说明，以均数加减标准差（ ）表示，并采用t-检验和最小显著极差法进行统计学比较，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1致敏豚鼠体重生长曲线

   不同浓度菌液致敏豚鼠后都未见异常状况，饮食、饮水正常，体重持续增加。各组别豚鼠虽然初始体重不一致，但在致敏后第5周，体重趋向一致。（见图1）。

图1 不同浓度灭活H37Rv全菌体致敏后豚鼠体重曲线

Figure 1  Guinea pigs weight gain subsequent to heat-killed H37Rv

 

2.2致敏后豚鼠注射部位变化

豚鼠注射灭活H37Rv全菌体不同浓度菌液后，注射部位均会出现溃烂。豚鼠注射部分在注射菌液后3周内未观察到溃烂，第4周有18.9%的豚鼠注射部位发生溃烂，第5周有33.3%的豚鼠注射部位发生溃烂，所有豚鼠注射部位均会出现结节。

2.3 各种致敏剂量接种后，红斑大小比较

致敏0.2mg/mL组，标准品激发后48h雌雄间比较，红斑纵横径均值有显著性差异，其他组别雌雄间无显著差异，；0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL组别间，标准品激发后24h红斑纵横径均值有显著性差异，以0.2mg/mL红斑纵横径均值为最大；0.2mg/mL、0.5mg/mL组别间，标准品激发后48h红斑纵横径均值无显著性差异。

3次致敏与单次致敏豚鼠皮试红斑纵横径均值24h及48h，测量结果无显著性差异。

多次重复皮试结果显示0.3mg/ml H37Rv全菌体致敏豚鼠皮试红斑纵横径均值，第1次皮试要好于以后重复多次的皮试结果。  

 3 讨论

豚鼠对结核分枝杆菌高度敏感，是世界公认的结核病实验动物模型。豚鼠模型是卡介苗测试、评价的首选动物。此外，豚鼠结核病模型也常常用于开发治疗结核病新抗生素或联合用药效果的评价[6]。自从结核菌素反应被罗伯特.科克在一个世纪前发现以来，豚鼠就成为研究迟发型致敏反应（DTH）的动物模型。豚鼠的DTH反应与人类进行的PPD皮试反应非常相似[6]。最后，豚鼠模型的肺部肉芽肿坏疽病理变化与人类也非常相似[7]。

通过本研究可以得出浓度为0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，豚鼠均能很好产生DTH反应，其中以0.2mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠标准品激发后红斑纵横径平均值最大，多次致敏皮试红斑纵横径均值与单次致敏差异不显著；第1次皮试红斑纵横径均值要好于以后重复多次的皮试结果。我们的研究结果显示24小时和48小时皮试红斑纵横径均值要明显大于张灵霞等[11]制备的模型，她采用0.1ml(5mg)灭活H37Rv全菌体4次致敏豚鼠，每周1次，24小时和48小时红斑纵横径均值分别为：8.25±1.73mm，7.41±1.22mm。Suely S. Kashino[8]应用18b结核分支杆菌制备豚鼠模型比应用灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠模型DTH反应要强烈，且会引起动物消瘦死亡，18b结核分支杆菌在致敏豚鼠后5周、14周、28周进行PPD皮试反应，24h后DTH皮试反应红斑纵横径平均值分别为18 ± 3mm，19 ± 0.7 mm，15.5 ± 1.9 mm。根据我们的研究结果和已知文献[8,11]，豚鼠模型DTH反应的强度与结核分支杆菌的死活、剂量有关系，与接菌次数关系较小。活结核分支杆菌可以引起豚鼠强烈的DTH反应，但也可能引起豚鼠死亡；采用较低剂量灭活H37Rv全菌体，DTH反应强烈。总之，H37Rv全菌体引起的豚鼠DTH反应具体机理还需要进一步研究。

人类感染结核杆菌后，会引起嗜睡、精神萎靡、体重减轻直至死亡等[9]，本研究应用灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，豚鼠体重持续增长，未观察到豚鼠有明显不适反应。注射部分出现溃烂主要是弗氏不完全佐剂引起的不良反应[10]，采用多点注射可以适当降低溃烂的发生率。

总之，本研究改进了制备灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠模型的方法，使应用灭活H37Rv全菌体致敏制备豚鼠模型更简单可靠，可以广泛应用于抗结核药物和相关生物制剂检测中。可参考0.2mg/mL灭活H37Rv全菌体在豚鼠大腿内侧腹股沟皮下多点注射来制备致敏制备豚鼠模型。