高血压是一种以动脉血压升高为特征的复杂的多基因疾病， 是冠心病、心肌梗死、脑卒中等主要危险因素之一， 其发病率和死亡率成逐年上升 的趋势，严重威胁人类健康。高血压的发生与收缩血管物质分泌增多或者活性增强， 舒张血管物质分泌减少或活性减弱有关。内皮型一氧化氮合酶(eN O S)在调节血压方面有重要作用。血管内皮细胞产生一氧化氮(N0 )， 作用于血管平滑肌细胞引起血管舒张，最终导致血压的下降。建立 eNOS 基 因敲除大鼠模型可为高血压的发病机制和治疗的研究奠定基础。

1 材料与方法
1．1 动物
SPF 级SD 大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SC X K (京)20 12．0001】 。所有实验用鼠饲养于中国医科大学实验动物部[SY X K (~ )2013．000 1]，温度为 24 ±2 ℃，相对湿度为 50％± 10％。自动光控(12 h 明，12h 暗)[SY X K (辽)20 13— 0007]。

1．2 eN O S 基 因敲除大鼠的制备
1．2．1 注射基 因纯化 利用锌指核酸酶(Z FN )技术 ，构建敲除载体 ，酶切线性化，用 A m b ion 公司的栅 SSA G E m M A C H IN E。 T7 U L TR A K it进行体外转录然后经 Q i agen 公司R nesay M ini K it进行纯化。
纯化后的片段溶于水中，一 80 ℃保存。注射前进行稀释 ，注射浓度为 10 ng／ ~tL 。

1．2．2 大鼠的超数排卵和受体的准备  选用 5 周龄SD 大鼠腹腔注射 PM SG 25 IU／只， 46" -~48 h 后腹腔注射hCG 25 IU ／只， 当日与正常 SD 雄 鼠1 ： 1合笼交配，次日早晨检查阴栓， 见栓的孕鼠做为供体鼠。超数排卵合笼的同时， 挑选野生型 SD 雌 鼠与结扎 SD 雄鼠交配 ，次日早晨检查阴栓，见栓 的孕鼠做为受体鼠。

1．2．3  采集受精 卵  采用颈椎脱位法处死供体雌鼠，收集输卵管 ，置于 37 ℃预热的M 2 培养滴中，在体视显微镜下撕破膨大部，获得卵母细胞 一 卵丘细胞复合体 ，经 1 m g／ m L 透 明脂酸酶处理后得到单个受精卵，在 M 2 中清洗 3～5 次后记录受精卵数量， 转入隔夜孵育的 K SO M 培养液中培养， 待注射 。

1．2．4 显微注射 将体外转录纯化的编码 eN O S 特异性锌指酶的 m R N A 注射到大鼠受精卵中，将注射后状态 良好 的受精 卵移转入CO z培养箱内孵育30 m in 后进行胚胎移植。

1．2．5 胚胎移植 按照0． 1 g／m L水合氯醛以0． 31 m L ／100 g 腹腔注射 SD 假孕大 鼠进行麻醉，酒精消毒后剪背肾部毛 ，切开皮 肤，在靠近输 卵管小弯处剪 口，将移卵管从剪 口处插入输卵管，将受精 卵吹进壶腹部，略停 留片刻再拔出。将 卵巢、输卵管 、子宫复位 ，缝合创口。

1．2．6 大鼠检测  剪取出生 l0～ 15 d 的仔 鼠尾部组织，在蛋 白酶 K 作用下 55 ℃水浴摇床过夜消化，酚氯仿法抽提 鼠尾基 因组 D N A ，设计的检测正向弓 l物： 5’ 一 T G T G TT C T C T C TT C T G G C T C A G G 一 3’ ， 反向引物： 5’ 一 C A A A G A TC c T rC C A  C G A A C ． 3 ，进行 PC R 反应， 条件如下： 预变性 94 ℃ 5 m i n， 94 ℃45 S，6O ℃ 45 S，72 ℃ 45 S，34 个循环，最后 72 ℃延伸 10 m in 。PC R 产物经测序 、T ．A 克隆，确定基因缺失情况 。

1．2．7  纯合子筛选 将原代阳性 鼠与野生型 SD 大鼠交配 ，产生 F 1 代杂合子大 鼠，F 1 代杂合子大鼠互相 交配 ，筛选纯合子大鼠。

1．3 W estern blot检测
取eN O S 敲除大鼠和SD 野生型大 鼠的心脏、肾脏组织 ，迅速置于液氮中，将组织粉碎 ，加入蛋白裂解液裂解 ，离心后取上清 ，即为总蛋 白。蛋白定量 、变性后进行 SD S PA G E 凝胶电泳、转膜 ，置 于 5 ％ 脱脂 牛奶 中封 闭，抗体 孵 育 ，一抗 为im m unow ay 公司抗体，二抗为山羊抗兔抗体，经E C L 化学检测发光试剂发光后成像，检测 eN O S 的表达情 况。同时以 G A P D H 作为 内参 。

1． 4 eN O S 基因敲除纯合子大鼠外观表型观察对纯合子大 鼠与同窝野生型大 鼠头部、躯干 、四肢 、尾 部等进行外观检查，观察是否有畸形 。

1． 5 组织学形态学观察
将 大 鼠处 死后 取 心 、肝 、脾 、肺 、 肾 、肌肉、腹主动脉血管组织， 放入 0 ． 25 g／ m L 多聚 甲醛中固定， 进行石蜡包埋， 切片， 苏木 素 一 伊红(H E )染色， 光镜下观察组织结构形态的改变并拍照 。

1． 6 体质量 比较选取野生型 SD 大 鼠雌雄 各5 只， eN O S 敲除大鼠雌雄各 5 只， 测量 8— 16 周龄的体质量， 进行比较 。

1． 7 心率、血压 、收缩压 、舒张压测定选取野生型 SD 大 鼠雌雄各 5 只，已 ⅣD 敲除大 鼠雌雄各 5 只，8~9 周龄 。使用 Softron B P一 20 10A仪 器 ，采 用尾套 法测 量 大 鼠心率 、 血压 、收 缩压、舒张压，每只大 鼠测量3 次 ，取平均值记为该大 鼠的心率 、 血压 、收缩压 、舒张压。
1． 8 统计分析
数据 以平均值 ±标准差  ± )表示，组问差异用 t检验 ，P < 0． 0 5 为差异有统计学意义 。

2 结果
2．1 eN O S 敲除纯合子大鼠基因型检测结果eN O S 基因敲除载体体外转录纯化后，注射到SD 大鼠受精卵中，共注 441 枚受精卵， 存活 365 枚，分别移入 12 只 SD 大 鼠输卵管，共产 出23 只 FO 代大鼠。PCR 产物测序分析共获得4只阳性大鼠，选择其中的 8 号大鼠进行传代繁育筛选纯合子 。该基因敲除阳性 大鼠第 4 外显子中缺 失 22 个碱基 ，导致其移码突变。

2．2 W estern blot检测
以G A PD H 作为内参成立的情况下，野生型SD大鼠心脏、肾脏表达 eNOS 蛋白，eN O S 敲除大鼠表达 eNOS 蛋白。

2．3 外观表型观察结果
eN O S 基因敲 除纯合予大 鼠出现肢体不同程度的缺 陷。

2．4 病理学观察
野生型 SD 大鼠动脉 内膜 内皮细胞为单层扁平状 、表面光滑 ，而 eN O S 基 因敲除大鼠动脉 内膜 内皮细胞肿胀 ，表面高低不平 ，外膜损伤(图4)。其他组织无 明显组织形态结构改变 。实验动物与比较医学 L aboratory A ni m al and C om parat ive M edi cine  A ug． 2015， 35( 4)
注： 与同性别野生型大鼠比较， P <0． 05，“P<0 ．0 1

3 讨论
    大鼠在生理、药理和行为研究方面，尤其在某些心血管疾病、行为学研究和神经学的研究比小鼠更有意义，是理想 的动物模型。大鼠在进化上 比小鼠更接近于人类，在一些炎症疾病 、神经系统疾病的研究中，使用大 鼠作为动物模型 ，其表型与人类临床表现更加接近。例如在转相同基因的阿尔茨海默病大、小鼠模型中，转基因大 鼠的表型与小鼠不完全相同，转基因大鼠模型能够有效的复制阿尔茨海默病中大脑的病理改变，其表型与人类疾病的发生更相似，更适合作为阿尔茨海默病的动物模型。由于大 鼠在生理、行为、代谢等方面的特点，使大鼠在生命科学研究中的作用 日趋重要。一些人类疾病，如高血压没有很好的小鼠模型，必须依赖于大鼠模型的建立。大鼠基因工程技术对大鼠模型的发展起到至关重要的作用。由于大鼠胚胎干细胞(E S 细胞)培养条件的限制，基于大鼠E S 细胞的传统基因打靶技术受到很大影响，这样使得不依赖于 ES 细胞的基因修饰技术显示出巨大的优势。近年来发展起来多种高效的研究工具，包括 ZFN s 技术 ，T A L EN s 技术[1 O和 C RISP C as9 技术，提供了基因组编辑的新方法 ，为研究基 因功能提供了新的途径。这些技术的应用不需要 ES 细胞打靶阶段， 其制备周期短， 效率高。

本研究利用 ZFN 技术建立了eN O S 基因敲除大鼠。该大鼠的第 4 外显子中缺失 22 个碱基，导致其移码突变。对基因敲除纯合子大鼠进行蛋 白表达检测发现该基因在肾脏和心脏中不表达，免疫组织化学实验显示同样的结果(结果未显示)，达到了基因敲除的目的。

对 eN OS 基因敲除大鼠的观察发现，纯合子敲除大鼠肢体有不同程度的缺损，而杂合子大鼠外观正常，敲除大鼠的体型小于野生型大鼠，对 8~ 16 周龄的大 鼠体质量进行比较分析，敲除大鼠的体质量和体质量增长幅度明显低于野生型大鼠。这与早期对敲除eN O S 的小鼠研究结果一致，敲除 eN O S 的雌鼠显示胚胎数降低， 死胎率高， 胎儿的个体更小【 12,1 3]。基因敲除大鼠由于肢体有不同程度的缺损，对采食也会造成一定程度的影响， 从而影响了体质量的增加。eN O S是调控血管功能的关键，同时在调节内皮细胞的血管形成过程中也发挥着重要的作用[ 1 4, 15]。本研究中对大鼠动脉的H E 染色显示， 动脉外膜明显损伤， 对血管功能将会有一定影响。eN O S 基因对肢体发育的影响在基因敲除小鼠中未见到表型，而在基因敲除大 鼠中表型明显，该基因对肢体发育的影响有待进一步研究。

在 eN O S 基因敲除大 鼠中，血压 明显增高 ，收缩压和舒张压也都显著增高。在机体正常生理情况下，血管张力主要由血管收缩因子和舒张因子共同调节。N O 作为体 内重要的血管舒张 因子，与其他 的舒张因子一起介导血管的舒张反应，并可抵抗体内收缩血管的物质 ，如血管紧张素 II、肾素等的收缩血管作用。在大部分 的血管中，内皮依赖的舒张功能主要 由于 eN O S 来源的 N O 产物，eN O S 下调可 以引起 N O 大量减少，减弱 了血管的舒张功能。在对eN O S 基因敲除小鼠的研究中显示，eN O S 基因敲除小鼠的血压与野生型小鼠相 比，血压明显升 ，在小鼠中证明了eN O S 影响血压水平。Savard 等 坞 研究显示，eN O S 基因转移可加强 N O 的释放，可能预防高血压 的加剧 。除了血压增加外 ，本研究观察到基因敲除雌 鼠的心率显著降低，雄 鼠心率没有显著变化。这可能是压力感受器的反射机制对血压升高的应答。综上所述 ，本研究成功建立了 eN O S 基因敲除大 鼠，可作为研究高血压发病机制的理想 的动物模型，同时为 eN O S 基因功能的研究奠定基础 。