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ELISA技术讲座三-试剂的选择（上）
2016年03月02日
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：ELISA技术讲座三-试剂的选择（上）
ELISA 中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的 ELISA 试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
3.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存 6 个月。有些不完
整的试盒，仅 供应包被用抗原或抗体，检 测人员需自行包被。以 下简述固相载体和包被过程。
3.1.1 固相载体
固相载体在 ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。可作 ELISA 中载体的材
料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原
吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑
料，可制成各种形式。
ELISA 载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用
于 EILSA 的产品称为 ELISA 板，国际上标准的微量滴定板为 8×12 的 96 孔式。为便于作少
量标本的检测，有制成 8 联孔条或 12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。
ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现
在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的 ELISA 检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步
骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的
吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值
较大。
良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空 白值低，孔底透明度高，各板之间、同 一板各孔之间、
同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品
的质量差异很大，因此，每一批号的 ELISA 板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法
为：以一定浓度的人 IgG（一般为 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀
释度的酶标抗人 IgG 抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸
光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度 0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读
数与全部读数的均数之差，应小于 10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可
剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸
附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可应用如下的试验：用 其他免疫学测定方法选
出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定
的 ELISA 操作步骤进行测定，然 后比较结果。在 哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，
这种载体就是这一 ELISA 测定项目的最合适的固相载体。
在 ELISA 中，用 作固相载体的小珠一般为直径 0.6cm 的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大
大增加。ELISA 板孔的吸附面积约为 200mm2，小珠均为 1000mm2，将近 ELISA 板孔的 5 倍。
吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再 者，球型小珠的表面弧度更有利于吸
附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因 此珠式 ELISA 的反应往往更
为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚
动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较
差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式
ELISA 的标本量一般为 100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加
有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为 ELISA 固相载体的。其优点是表面积极
大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA 固相载体，
反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载
体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构
上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白
质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋
白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG 对聚苯乙
烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在 Fc 段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的
包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定
簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，
在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异
抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体
表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在
固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法（见 2.2.4），试
验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅
为直接包被的 1/10 乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的
包被方式。例如，在检测抗 DNA 抗体时，需用 DNA 作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不
能直接与核酸结合。可 将聚苯乙烯板先经紫外线照射（ 例如 30W 紫外灯，7 5cm 照射 12 小时），
以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提
高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入
生物素化的 DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可 将其在有机溶剂（ 例如乙醇）中 溶解后加入ELISA 板孔中，
开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的
ELISA 试剂一般采用这种包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg 可以从
携带者的血清中提取，一 般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富
含此抗原的材料中提取等（例如 AFP 从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒
体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份
外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如
不能充分除大肠杆菌成份，用于 ELISA，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌
感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重 组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从
天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血
清中 HCV 抗原含量极微。目前检测抗 HCV ELISA 中所用包被抗原大多为根据 HCV 的基因克隆
表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如 HBsAg、HBeAg 和 HIV 抗原等均
在 ELISA 中取得应用。合 成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列
人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于
分子量太小，往 往难于直接吸附于固相上。多 肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛
血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表
面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多
个不同的能引起抗体产生的决定簇，因 此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生
反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗
原进行包被可引起其他抗体的漏检。
3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可 取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或
培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除
去（可用吸收法）后才能用于 ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应
先提取 IgG，通常采用硫酸铵盐析和 Sephadex 凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的 IgG
已可用于包被，高度纯化的 IgG 性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感
性，则 可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性 IgG。腹 水中单抗的浓度较高，
特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，
必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某
些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的 pH 等应根据试验的特点和材
料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用
pH7.2 的磷酸盐缓冲液及 pH7~8 的 Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在 ELISA 板孔中加
入包被液后，在 4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2 小时被认为具有同等的包被效果。包
被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每 批材料需通过实验与酶结合物的
浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为 100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗 原或抗体包被时
所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白
质充填这些空隙，从而排斥在 ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相
类似。最常用的封闭剂是 0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用 10%的小牛血清或 1%明胶作
为封闭剂的。脱 脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其 最大的特点是价廉，可 以高浓度使用（ 5%）。
高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后
的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的 ELISA 固相均需封闭，
封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操
作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量
非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测
定中，封闭一般是不可少的。包被好的ELISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
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