基因敲除(gene knock-out)，也称为基因打靶(gene targeting)，是转染的外源DNA序列与细胞内的同源基因组序列间的同源重组过程。众所周知，同源重组(homologous recombination，HR)是生物界广泛存在的一种遗传信息转换方式，又称为一般性重组或非特异性重组(general  recombination)。它是指发生在减数分裂或有丝分裂过程中，依赖于大范围的DNA同源序列间的联会，相似DNA序列间彼此交换遗传信息的过程，重组可以发生在联会部分的任何位置上。同源重组在进化过程中高度保守。与位点专一性重组(site-specific recombination)或转座重组(trans-positional recombination)不同，它不需要特定的DNA序列，它可以发生在任何共有足够的特异性的两个序列间，即通过一对同源非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。这也是细胞内普遍存在同源重组的原因。而位点专一性重组依赖于少量DNA同源序列间的联会，但联会只限于某些序列，而且也只是在这些序列中发生重组，因此称为非同源重组。而转座重组则不依赖于同源序列，而与转座酶的作用直接相关。

细胞同时存在两种DNA损伤修复机制，且都能引起基因组DNA的靶向修饰。①经非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)途径修复。该机制不使用同源模板进行修复，而是通过连接DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB)末端，造成基因组DNA产生小片段的插入或者缺失，往往引起移码突变，导致基因的敲除。②当与靶位点基因组序列同源的供体DNA存在时，会通过同源重组途径修复(homology directed repair，HDR)，使基因组DNA切割部位发生基因的替换。该机制依赖于DNA模板才能对DSB进行修复。即必须有同源序列的模板及位点专一性核酶的存在才能实现。HDR能忠实地将供体DNA分子插入到靶位点。该修复可实现单个或者多个基因插入，以及单核苷酸取代。在实践操作中，两种修复途径各自所占的比重与细胞类型、细胞周期阶段以及造成细胞损伤的原因密切相关，可通过调节有关DNA修复的关键分子，从而在一定程度上使细胞偏向某个修复途径。

基因敲除的实质是通过同源重组，将外源基因定点整合入靶细胞基因组某一确定位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。通过基因敲除可以改变特定的基因组序列，分析基因的结构和功能，建立疾病动物模型，以研究人类疾病的分子机制以及遗传病的治疗等。总体可实现两种类型的遗传改变，即重新恢复遗传功能(GOF)或破坏／敲除原有遗传功能(LOF)。目前主要的敲除策略都是属于后一种类型。