3.2 结合物

结合物即酶标记的抗体（或抗原），是 ELISA 中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有
酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有
恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体
（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。

3.2.1 酶

用于 ELISA 的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来
源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标
本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定
等。

在 ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶
(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品 ELISA 试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β
-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

国产 ELISA 试剂一般都用 HRP 制备结合物。HRP 是一种糖蛋白，含糖量约为 18%，分子量为
44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋
白质。主 酶无色糖蛋白在 275nm 波长处有最高吸收峰，辅 基是深棕色的含铁卟啉环，在 403nm
波长处有最高吸收峰。HRP 的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是 403nm
的吸光度与 280nm 吸光度之比，高纯度的 HRP 的RZ≥?.0。

HRP 除符合上述的 ELISA 中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意
的是，在选用酶制剂时，除其纯度 RZ 外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活
力也会降低。酶 制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定
进行试验。

国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的 AP 有两个来源，分别从大
肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的 AP
分子量为 80000，酶作用的最适合 pH 为8.0；用小牛肠膜中提取的 AP 分子量为 100000，最
适 pH 为 9.6。在 ELISA 中，AP 系统的敏感度一般高于 HRP 系统，空白值也较低，但AP 价格
昂贵，制备结合物所得率也较HRP 低。

3.2.2 抗原和抗体

制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。
最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行
反应，实验结果本底浅淡。如用 F(ab')2 进行标记，则更可避免标本中 RF 的干扰。在ELISA
中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。

3.2.3 结合物的制备

酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联
结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接
加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。

ELISA 中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达 60%-70%）和重复
性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大
小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊
二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二
醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以 1:1 的比例结合的，较一
步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。

（2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。
反应时，过碘酸钠将 HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成
Schiff 氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简
便有效，一般认为是 HRP 最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结
果不易重演。

按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离
酶一般不影响 ELISA 中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最
终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到
固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，
效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，
但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结
合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制
备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但
费用较贵。

结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不
经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的
浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并
获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，
它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。
例如某一 HRP：抗人 IgG 制剂标明的工作浓度为 1:5000，表示该制剂经 1:5000 稀释后，在
与人 IgG 包被的固相作 ELISA 试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的 ELISA 检测中，酶
标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包 被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标
本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度
的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。

3.2.4 结合物的保存

酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保 存不当，极 易失活。高 浓度的结合物较为稳定，
冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而 且使用时需经
复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时
间保存。早 期的ELISA 试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配 以稀释液（ 见3.2.5）
临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现 在较先进的 ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成
工作液，使用时不需再行稀释，在 4-8℃保存期可达6 个月。由于蛋白质浓度较低，结合物
易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP 结合物加
硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。

3.2.5 结合物的稀释液

用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为 避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在
稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如 1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合
物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温 20，
0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀
释液。

3.3 酶的底物

3.3.1 HRP 的底物

HRP 催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为 H2O2，其反应式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O

上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。在 ELISA 中，DH2 一般为无色化合物，经酶作用后
成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、
四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) 和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-
ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比
色方便，是 HRP 结合物最常用的底物。OPD 本身难溶于水，OPD·2HCL 为水溶性。曾有报道
OPD 有致异变性，操作时应予注意。OPD 见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不
稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD 和 H2O2 一般分成二组分，OPD 可制成一定量的粉剂
或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制
成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先 进的 ELISA 试剂盒中则直接配成含保护剂的工
作浓度为 0.02% H2O2的应用液,只需加入 OPD 后即可作为底物应用液。

TMB 经 HRP 作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需
与 H2O2 溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 又有无致癌性等优点，因此在
ELISA 中应用日趋广泛。酶反应用 HCL 或 H2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色
计中定量，最适吸收波长为 405nm。

ABTS 虽不如OPD 和 TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种 HRP 的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经
HRP 作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于 ELISA 的优点为可加宽定量测定的线
性范围。

HRP 对氢受体的专一性很高，仅作用于 H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea
peroxide)。H2O2 应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较 H2O2 方便、稳定。试剂盒
供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定 1
年。

3.3.2 AP 的底物

AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可
制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处有吸收峰。用 NaOH 终止酶
反应后，黄色可稳定一时间。

AP 也有发荧光底物（磷酸 4-甲基伞酮），可用于 ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色
底物的比色法。

3.4 洗涤液

在板式 ELISA 中，常用的稀释液为含 0.05%吐温20 磷酸缓冲盐水。

3.5 酶反应终止液

常用的 HRP 反应终止液为硫酸，其 浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式 ELISA 中一
般采用 2mol/L。

3.6 阳性对照品和阴性对照品

阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制
品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测
标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各
种 ELISA 模式中可产生不同程度的本底。由 于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对
照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中
的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，
确定其中不含待测物质。例如 HBsAg 检测的阴性对照品中不可含 HBsAg，最好抗HBs 也是阴
性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好
在试剂说明书中标明。加 入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本
吸光值比较，可 对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测 HBsAg 的 ELISA 试剂盒
检测敏感度约为 0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为 10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和
防腐剂，以利保存。

3.7 参考标准品

定量测定的 ELISA 试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考
标准品，应包括覆盖可检测范围的 4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液
中。