欢迎您推荐或发布相关实验技术、实验攻略、实验经验分享等。
荧光原位杂交实验方法及步骤
2016年03月16日
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：荧光原位杂交实验方法及步骤
2.38.1 实验方法及步骤
(1) 探针变性
将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
(2) 标本变性
a.将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。
b.取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
c.立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。
(3) 杂交
将已变性或预退火的DNA探针10μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。由于杂交液较少，而且杂交温度较
高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
(4) 洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
a.杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
b.将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
d.在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
e.取出玻片，自然干燥。
f.取200μL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
(5) 杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针)
a.在玻片的杂交部位加150μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
b.去掉保鲜膜，再加150μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
c.取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
d.在玻片标本的杂交部位加150μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。
e.去掉保鲜膜，加150μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。
f.取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
g.重复步骤(1)、(2)、(3)，再于2×SSC中室温清洗一下。
h.取出玻片，自然干燥。
i.取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
(6) 封片
可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用)，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在—20～—70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
(7) 荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。
所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择
2.38.2 相关溶液的配制
(1) 20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL(用10mol/L NaOH调pH 至7.0)。
(2) 去离子甲酰胺(DF)：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatman l号滤纸滤。
(3) 体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。
(4) 体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。
(5) 体积分数50%硫酸葡聚糖(DS)：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
(6) 杂交液：8μL体积分数25%DS，20μL 20×SSC混合。(或40μL体积分数50%DS，20μL 20×SSC，40μL ddH2O混合)取上述混合液50μL，与5μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10%DS，2×SSC，体积分数50%DF。
(7) PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100μg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，-20℃保存备用。
(8) DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。
(9) 封闭液I：体积分数5%BSA 3mL，20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5μL混合。
(10) 封闭液II：体积分数5% BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250μL,ddH2O 750μL,Tween20 5μL混合。
(11) 荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5μL混合。
(12) 洗脱液：100mL 20×SSC，加水至500mL，加Tween20 500μL。
上一篇：细胞转染方法[ 03-16 ]
下一篇：大鼠大脑中动脉缺血、再灌注模型的建立方法细节、注意事项、模…[ 03-16 ]
相关文章
- 没有相关内容！
