自20世纪80年代初建立转基因小鼠以来，目前已发展出多种转基因方法，可以将几kb到上百kb大小的外源基因导入小鼠基因组。

1．原核注射法

从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的原核时期，尤其是雄原核。精子进入卵细胞后1h，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下更容易看到雄原核。因此，一般转基因过表达小鼠模型都是通过原核注射法(pronuclear injection，PI)将DNA溶液注入处于1细胞期的胚胎原核中获得。注射时间应选在精卵融合后的受精卵有丝分裂s期进行，外源基因可以借助受精卵自身基因组DNA复制时形成的缺口或缝隙及重组过程，整合到受精卵的基因组中。

迄今为止，在育成能够整合表达外源基因的真正意义上的转基因哺乳动物方面，显微注射技术仍不失为最经典有效的途径。其特点是任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内，具有转基因效率稳定、注射基因大小不受限制、无须载体的特点。其缺点是外源基因整合的拷贝数和整合位点都不具有确定性；当外源基因整合到染色体组的非活跃区时，会产生位置效应，导致其低表达或不表达；生产转基因动物效率低，后代嵌合体比例高，尤其是大动物，受体需要量大。因此显微注射技术一般是制备转基因小鼠、大鼠、兔等小动物的首选方法。基本步骤如图1-6所示。

2．将若干个DNA片段共注射

同样利用原核注射原理，只是利用了共注射的DNA容易共同整合到小鼠基因组上的同一位点的优势。该方法有助于简化操作步骤，即省去将若干个插入片段连接到一个载体上的工序，其缺点是无法预知各个片段间的连接顺序以及拷贝数等信息。

3．精子载体法

是以精子作为外源基因载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，使外源基因进入子代基因组中的转基因方法。动物精子具备自发结合和内化转运外源DNA的能力，将精液与外源DNA直接混合孵育，吸附外源性DNA精子可达63%左右，且精子在吸附DNA后仍保持良好的活力。由于精子能携带外源基因入卵和数量丰富这两大特性使精子作为载体制备转基因动物成为一个简便、经济的途径。可分为体外和体内精子转染法两大类。

体外精子转染法中的恒温共孵育法是制备转基因动物最早使用的方法。1971年Bracketc等发现兔精子能与共孵育的SV40 DNA结合。1989年，Arezzo等报道动物精子具有潜在的结合外源DNA并在受精过程中将其转入卵内的能力。1999年Perry等将精子破膜并与DNA混合后，进行精子的胞质内注射受精，外源基因在20%后代中获得了有效表达。目前已获得了猪、牛、羊、兔和小鼠等动物的转基因后代，其中小鼠、猪和兔子建立起了表达外源基因的转基因品系。如今，脂质体辅助精子载体法转染效率较高、毒性较小，且可保护DNA不被核酶降解，已在鸡、兔和小鼠上获得成功。

图1-6 原核注射法转基因基本步骤

将构建好的质粒DNA酶切片段经显微注射导入小鼠受精卵雄原核中，体外孵育至2细胞到或桑葚胚期，经手术法移植到受体母鼠输卵管中，后代经鉴定，筛选出转基因杂合子小鼠(a)。

体内精子转染法又根据转染部位不同分为输精管、曲细精管和睾丸注射法等。①输精管注射法，是将含目的DNA的重组质粒一脂质体复合物注入雄鼠输精管内，再用阳性转染雄鼠与雌鼠交配。由于被转染的是已失去增殖能力的成熟精子，因此，难以得到可长期产生阳性转染精子的雄性动物。②曲细精管法是将含外源基因的转染液，经手术方法注入曲细精管中，或注入后再结合电穿孔，使转染精原细胞发育成熟精子中携带有外源基因。该方法更简便易行，且不需要专用设备。目前已在小鼠转基因上取得了成功。③睾丸内注射是基于曲细精管法，通过对睾丸进行多次打点注射，将外源基因转入曲细精管内，并经渗透作用整合到精原细胞和精母细胞的染色体中，从而获得大量的转染精子。我们将质粒DNA与趋磁细菌产生的纳米级生物材料，磁小体(bacteria magnetic particles，BMPs)和聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)充分混合后，注射入小鼠睾丸组织内，在外加磁场中作用30 min后将睾丸还纳入腹腔并完成手术。随后从16只仔鼠中获得了8只(50%)转基因阳性鼠。

与体外孵育相比，体内精子转染法在转染过程中，外源DNA的导入不受到精浆中抑制因子的影响，避免了体外孵育精子活力的下降，从而提高了获得转基因动物的概率。然而，精子载体法的转基因动物阳性率及重复性均不好，作用机理尚不明确，外源基因导入精子体内可能被降解及降解机理不清楚，整合后外源基因的表达遗传规律不清楚。因此，精子载体法目前仍处于理论试验研究阶段。

4．病毒感染法

慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科，通常是在人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）病毒基础上改造而成的病毒载体系统。利用该载体感染宿主细胞时，病毒RNA反转录为DNA后可以整合到宿主细胞染色体上并具有长期稳定表达的特性。同为病毒载体的腺病毒载体转染无法整合到宿主细胞染色体上，而逆转录病毒载体只能转染分裂细胞，只有慢病毒载体能对分裂细胞和静止细胞都完成稳定表达的转染，且不易诱发宿主免疫反应，因此成为应用广泛的基因转移载体。是除原核注射法外的一种高效率转基因法，已在小鼠、大鼠、猪和非人灵长类上成功。应用此方法，2001年培育了世界首只转基因猴ANDi(inserted DNA，DNA植入)；2009年培育出了生殖系传递的普通狨猴。我国研究人员也先后利用该方法获得了转GFP基因小鼠和猕猴。

主要方法有：①将目的基因重组到慢病毒载体上，重组病毒载体感染包装细胞后制成高滴度的病毒颗粒，直接注射到受精卵的卵周隙，经胚胎移植制备转基因动物；②注射到卵母细胞的卵周隙，体外受精后经胚胎移植制备转基因动物；③用病毒颗粒感染动物体细胞，经核移植制备转基因克隆动物；④通过将病毒载体整合到精原干细胞DNA上，再经自然交配制备转基因动物。

慢病毒载体法的优点是免疫原性低，不影响病毒载体的第2次注射，外源基因的整合率较高，多属单拷贝整合，宿主范围广。缺点是载体容量有限，外源基因片段长度通常小于10 kb，因而转入的基因很容易缺少其邻近的调控序列。同时慢病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达，以至整合后的表达率低。且外源基因难以植入生殖系统，所得转基因家畜大多为嵌合体，需要广泛的杂交，以建立转基因系。携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组时可能激活基因组DNA序列上的原癌基因或其他有害基因，安全性存在怀疑。

5．ESC转基因

可以实现大量的带有随机整合转基因的细胞克隆。过表达的转基因可以在体外条件下（细胞和分子水平）进行验证，之后再导入胚胎。此外，该方法可以绕过原核注射法所需的技术和设备要求。

6．生殖干细胞转基因

主要利用干细胞转基因可遗传的特点，获得整合位点不同的转基因动物。包括精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)法和原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)法。

SSCs是雄性动物睾丸内能够自我更新，具有生精能力并能将遗传信息传递给下一代的一类细胞。在体外培养期间用病毒载体感染后，利用曲细精管、睾丸输出管或睾丸网注射法移植给受体动物，能够产生转基因精子，最终获得转基因后代。2008年利用腺相关病毒载体(AAV)感染小鼠SSCs，后代转基因阳性率10%;感染山羊SSCs，经体外受精得到了10%的转基因胚胎。该方法优点在于SSCs本身就生殖干细胞，可不断产生精子；外源基因导入SSCs后可遗传；转基因精子可用于人工授精或者自然交配。因此，操作简单、容易推广、转基因效率高，是一种简便易行的转基因技术。

PGCs是指能够发育成为精子或卵子的祖先细胞，来源于胚胎生殖嵴的全胚层多能干细胞(pluripotent  stem  cells)。2002年从早期鸡胚血液分离得到了PGCs，利用脂质体法导入LacZ基因后注入受体胚，53只鸡胚发育到第3天，且在生殖嵴表达了LacZ基因。但没有成功获得转基因哺乳动物的报道。

7．转基因体细胞经核移植获得转基因动物

由于供体细胞可以通过基因敲除等技术进行定点基因修饰，经筛选得到阳性细胞进行移植操作，因此具有子代百分之百是转基因动物，不会生成嵌合体，动物使用量少等优势。1997年英国罗斯林研究所与PPL公司合作，利用该技术获得了世界上首只体细胞转基因克隆动物绵羊多莉。目前在制备转基因猪、犬、牛和羊等时，通常采用本方法，应用潜力巨大。而且对于这些尚未建立起ESC系的动物，还可利用体细胞核移植技术(nuclear transfer，NT)制备基因敲除动物。如用基因敲除及克隆的方法制作出了敲除α-1，3-糖苷转移酶的转基因猪；Kuroiwa(2004)通过敲除牛朊蛋白(PRNK)基因获得了无疯牛病牛和能合成多不饱和脂肪酸的猪等。近年来体细胞核移植效率有所提高，尤其是牛，但其最高效率也仅为10%。由于供体细胞核重编程（包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色体结构改变等表观遗传的改变）的效率问题，克隆动物往往具有“三高”的特点，即流产率高、围产期死亡率高、新生儿死亡率高。另外，即使新生后代健康，其生命后期仍多表现为寿命短、免疫功能缺陷、糖尿病和肿瘤等。

8．诱导性多能干细胞法

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)法。2006年，Shinya Yamanakad等在iPS领域的发现分享了2012年诺贝尔生理学／医学奖。2009年北京生命科学研究所高绍荣博士和中国科学院动物研究所周琪博士分别利用iPS细胞，通过四倍体囊胚注射得到了存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了iPS细胞具有与ESC相似的全能性。2011年，Wu等将延胡索二酰乙酰水解酶(FAH)基因表达缺失小鼠（患有I型络氨酸血症）的体细胞诱导iPS细胞，并利用慢病毒载体法使iPS表达正确的FAH，随后将这些iPS注入囊胚获得了表达FAH的转基因小鼠。

目前这一技术刚刚起步，还有许多问题等待解决。一方面，体细胞重编程的效率仍然很低，小鼠为0.1%～0.2%，而人为0.02%；另一方面，尚无法保持iPS细胞的多能性，如何定向可控地诱导iPS细胞等问题也亟待解决。但将iPS细胞作为核供体细胞，应用到体细胞核移植中也是一个非常不错的选择。因此，利用iPS细胞进行转基因和基因敲除等遗传修饰，为转基因动物的研究提供了全新的思路。

综上所述，受精卵原核显微注射法是目前制备转基因小动物最常用最成熟的方法，而转基因体细胞克隆技术是目前世界各国科学家比较常用的家畜等大动物转基因技术。根据不同的实验需求、实验室条件和不同的制备动物，研究者应选择适宜的外源基因导入方式，并根据导入方式和目的基因特点，选择与之相匹配的导入基因表达载体。经过转基因动物的建立和鉴定，转基因品系的繁育和表型鉴定最终获得新的转基因动物品系。