2.5.1.1   DNA斑点杂交

首先提取待检动物DNA并点样于尼龙膜（或硝酸纤维素膜）等固体支持物上，再和所设计的探针杂交，通过放射自显影检测样品中是否存在目的DNA序列。根据点样方式和样品点的形状不同分为斑点杂交(spot blot hybridization)和狭缝杂交(slot blot hybridization)。

该方法对样品纯度要求低、方法快速简便、经济且灵敏度高（能从2～5µg的基因组DNA中检出整合的单拷贝基因）。当目的基因与内源基因组DNA无同源性时，该方法适用性高，但为了避免假阴性，要用质粒DNA(1～10 pg)作阳性对照。在分析基因组DNA时，尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性，可作为首选方法。

其缺点是若所整合的外源基因与内源基因同源，往往会出现假阳性。此外，在技术上，由于提取的染色体DNA较为浓稠，加之整合的拷贝数低，杂交效果有时不理想。因此，该方法虽简单却很少被用于转基因动物筛选。

2.5.1.2  聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术即DNA体外扩增技术，与体内DNA复制的过程相似。该技术只需设计一对特异性引物，以提取的组织DNA为模板进行PCR即可，由于PCR所需样品少，灵敏度高而且操作简便因而逐渐用于转基因动物外源基因整合、表达的检测。PCR检测技术使转基因动物的筛选工作大为简化，尤其在大型转基因动物研究中，用PCR先对着床前的胚胎筛选，再将已证实携带外源基因的胚胎植入母体，极大地提高了转基因效率，减少人力、物力的浪费。

但该方法要求待分析的基因组DNA样品应尽可能纯化，否则会干扰本反应，降低检测的灵敏度和重复性；此外，用于大批量检测时，费用较昂贵。由于PCR技术有时存在假阳性，特别是扩增出内源性片段，对转基因的筛选影响较大，需要谨慎设计引物。引物设计时，尽量寻找所扩增片段与内源性基因无同源性的区域；如果目的基因与内源基因同源性高，则要求所设计的引物应保证在其3'端有几个碱基与内源性基因不一致，并通过提高退火温度来消除非特异性片段的扩增；应选择扩增基因的外显子，而不是内含子；在正式筛选前，一定要设立阴性对照和阳性对照以改进PCR的反应条件，确定PCR反应的最佳参数。

2.5.1.3  核酸印迹杂交

核酸印迹杂交(Southern Blot)是DNA和DNA分子之间的杂交。目前所采用的最具有权威的转基因动物鉴定方法。首先，提取待测小鼠组织的染色体DNA并酶切（一般选择在插入基因中有单一限制酶位点的酶）消化后电泳。第二，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，然后选择与所涉及的基因的适当探针杂交，通过放射自显影来鉴定结果。该方法的优点是：灵敏且准确，当转入基因与内源基因组DNA有较高同源性时适用性好。其缺点是从鼠尾提取的DNA不仅要求纯度高、质量好，而且量要大，因而往往不易实现。此外，DNA经限制酶消化后断裂的程度也影响Southern blot的结果。第三，操作烦琐，费用也较高。因而目前用此方法进行转基因动物初步筛选很少见报道，主要应用于在使用其他方法如PCR等初步筛选后，做最后的确定。

2.5.1.4整合位点的检测一染色体原位杂交

染色体的原位杂交(in situ hybridization)是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段，其原理是利用碱基互补的原则，以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA片段作探针，与染色体标本上的基因组DNA在“原位”进行杂交，经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察目的DNA片段在染色体上的位置。最早的同位素标记多采用放射性较低的³H、³⁵S及¹²⁵I，它们都具有定位精确的优点，但放射自显影时间长且操作较麻烦，影响了使用和推广。随着荧光显微镜技术的发展，尤其是计算机图像处理系统的应用，促进了非同位素检测法在染色体原位杂交中的应用。该方法虽然操作较复杂，但其独到之处在于其能确定出外源基因在染色体上的整合位点以及整合状态。

2.5.1.5  整合拷贝数的检测

外源基因的拷贝数通常以每个单倍体细胞中整合外源基因的分子数来计算。测定拷贝数的方法有斑点杂交技术和Southern blot技术等。其基本原理是在杂交实验中设置一系列阳性标准对照，然后将待测样品的结果（曝光或显色程度等）和阳性对照比较，进而确定转基因整合的拷贝数。

与普通的杂交不同，该杂交是一种定量杂交，需要高度纯化和已准确定量的基因组DNA。一般的加样量依次为0.5、1、2、4和8 g基因组DNA，然后用1～100 pg的梯度转基因片段为阳性对照和定量标准，最后计算出每个细胞中外源基因的拷贝数。

总体上讲，基因水平的检测可选用Southern blot结合斑点杂交和PCR检测，或在子代动物数量较少时，可直接选Southern blot。若转基因与内源性基因同源性较小，且检测数量大，首选斑点杂交进行粗筛，然后作Southern blot，以便对完整的外源基因进行鉴定和确定其是否整合，再用染色体原位杂交和定量斑点杂交分别作整合位点和拷贝数的鉴定。若同源性较高时，选用适当限制性内切酶酶切后也可用Southern blot分析。还可设计特异性高的引物用PCR法作外源基因是否整合的鉴定。