2.5.5.1  分离鼠尾DNA

小鼠DNA可以方便地从小鼠尾巴组织中提取，同时为了能对小鼠进行逐一辨认，常使用剪小鼠脚趾的办法进行编号。取断乳期（生后2～3周）乳鼠，无菌减去鼠尾约3 mm，放入1.5 mL离心管中，做好标记。注意取材时每个动物使用不同的手术器械，或将用过的器械用酒精棉球擦拭灼烧后再用。同时对乳鼠做剪脚趾或剪耳标记，以方便随后与检测结果对应及查找。雌雄鼠断乳后分窝。

(1)在离心管中加入350µL鼠尾组织缓冲液和35µL蛋白酶K。55℃孵育并振荡混匀过夜。

(2)离心，转移上清液至新管并加入等体积的饱和酚抽提上清液。

(3)加入等体积的酚：氯仿：异丙醇(25：24：1)(V/V/V)，抽提上清液。

(4)等体积的氯仿：异丙醇(24：1)(V/V)抽提上清液。

(5)加入0.4倍体积(约154µL)DNA沉淀溶液，混匀后放置冰上2h，或4℃过夜。

(6)室温离心6 min，弃上清液。

(7)加入1 mL 70%乙醇，轻轻颠倒离心管几次，室温离心2 min，立即弃上清液，可见沉淀的DNA。重复本步骤一次。

(8)干燥30 min后，加入100µL的TE缓冲液混匀。取5µL测OD₂₆₀值。

2.5.5.2   PCR检测

1．PCR产物的大小

一般扩增200～1 000 bp的靶序列即可，而300 bp的产物片段比较理想。如果想通过PCR来确定靶基因的完整性，则可以两个不同的PCR来扩增两端序列来实现。但要准确证实转基因整合的完整性，Southern blot分析和DNA测序是最可靠的。

2．设计和制备合适的引物

必须从目的基因结构内部和外部同时考虑。引物可以设计2对。一对可以跨越待测基因内部与其5'或3'端序列；一对位于待测基因内部，用于对初始扩增进行嵌套扩增。设计时，引物长度在15～30 bp为宜。要尽量减少引物二聚体的出现，尤其是不要上下游引物出现3'端有3个以上碱基可以互补配对的情况。G/C含量控制在40%～60%为宜。

3．对照设定

取1～2 pg的质粒DNA作为阳性对照。为避免污染及确定理想退火条件，阳性对照PCR最好单独操作。将1g小鼠基因组DNA和阳性对照质粒混合可以模拟基因组PCR的条件并确定低背景PCR的条件。通常还需要做阴性对照，即样品不加任何DNA，以检测试剂或材料是否污染（图2-12）。

图2-12 PCR方法检测转X基因的Founder小鼠

从图2-12中可见X4、X-6、X-7、X-8、X-13和X-16均为转基因阳性。

2.5.5.3   Southern Blot检测

当PCR方法无法确定转基因阳性时，可以采用本方法。通常用基因组Southern blot来筛选founder小鼠和大鼠，以建立稳定的遗传品系。但如果要从插入转基因的杂合品系中分出纯合品系，则不能使用本方法。

根据电泳后杂交扫描结果判定，如果整合是以串联方式头对头排列，则用限制性内切酶剪切后，会因为单一切割位点的不对称切割，造成产物大于或者小于标准单位长度的产物（电泳条带显示与标准条带比，目的条带大小不一）。如果整合拷贝是头尾相接，则酶切产物将形成完整的，与标准单位长度等长的产物（电泳条带单一）。如果同时将标准产物按浓度梯度跑电泳（用同一种限制性内切酶酶切已知浓度梯度的质粒DNA）后杂交，则可以按照目的条带亮度与标准品的亮度差异来判定目的片段的浓度。

如果宿主中含有与转基因类似的拷贝基因，则需要使用不同于宿主基因的限制性内切酶来切割，探针也可以使用分别针对内源性和外源性同源基因的两套。这样，在电泳后杂交条带上，除了显示出宿主的酶切产物，还可以有转基因产物的条带。此时，借助宿主条带与标准品的条带亮度比，通过判定转基因条带的亮度是否是标准品的整数倍，来说明整合是否完整。当目的条带与宿主自身拷贝的条带亮度成正比，转基因条带与目的条带间是整数倍，则说明转基因是完整的整合；否则可能是嵌合体。根据以上亮度比对方法，也可以区分转基因后代是杂合子还是纯合子。

1．琼脂糖凝胶电泳

消化5～10µg鼠尾基因组DNA需要消耗5倍质量的限制性内切酶。使用琼脂糖凝胶电泳分离各个酶解DNA片段：TAE缓冲液，0.8%琼脂糖凝胶，用Hind Ⅲ消化的λDNA作为分子质量marker，20 V电压，16 h。拍照成像。

2．硝酸纤维素薄膜转印
(1)将胶切成合适大小，切去右上角做记号。

(2)将胶放入含有变性缓冲液(1.5 mmol/L NaCI，0.5 mol/L NaOH)的盘子中轻轻摇动15 min。

(3)换到中和缓冲液(1 mol/L Tris-HC1，pH 8.0，1.5 mol/L NaC1)中轻轻摇动30 min。

(4)裁一张硝酸纤维素膜，2～4张3 mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），滤纸和膜的大小要求都与胶的大小相同或略小，以防形成旁路。先将膜浸入水中，再放入10×SSC中，接触胶和膜时都要戴橡胶手套操作。

(5)平盘上放一块比胶大的平板（可以使用盛胶槽的背面），上面铺一张3 mm滤纸，起虹吸作用，盘中加少量10×SSC缓冲液（2.5 cm厚），不能没过平板，使3 mm滤纸成分饱和。

(6)将胶倒扣到3 mm滤纸上。

(7)浸湿的硝酸纤维素薄膜铺在胶上，对齐，铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

(8)膜上放一张3 mm滤纸，不能与胶接触。

(9)上面覆盖吸印纸及重物（500 g左右）。

(10)通过滤纸的灶芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸

引到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。

(11)去除上面的物品，用镊子将膜取出，在6×SSC中清洗。自然干燥，80℃

烤2h。

(12)此时可将膜与探针杂交后进行判读，或室温密封保存。