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实验攻略

转基因表达和表型的误区

2016年03月21日 浏览量: 评论(0) 来源:《基因修饰小鼠制备常用技术》 作者:王超主编 责任编辑:wlladmin
摘要:转基因表达和表型的误区

首先,转基因表型往往会严重依赖于基因表达水平。比如,如果抑制性突变蛋白的表达水平不够高,则残留的内源性野生型蛋白活性可能会完全或者部分地恢复其野生型表型。此时,只能将转基因表型与敲除目的基因的小鼠表型相对照,才能确定是否是这种情况。这方面的典型例子,比如两个在角化细胞特异性表达的显性抑制性Rac1突变蛋白转基因品系间出现的情况,其中,两种转基因品系动物都对角化细胞体外生长时和体内条件下的伤口愈合起到了微弱的表型影响。在角化细胞中Rac1基因被敲除的小鼠,出生后2周毛发全部脱落,伤口愈合能力显著下降,并且Rac1敲除角化细胞在体外不增殖,也无法进行体外培养,如图2-13所示。同样地,在转基因显性抑制型小鼠中,其表型出现了温和变化,原因是尽管转基因表达起到了微弱改变其表型的作用,但转基因的抑制效应不足。

 

 

图2-13 Rac1 基因敲除鼠表型差异

(引自Kristina等, 2012)

 

其次,转基因小鼠表达非突变野生型蛋白或者组成性活跃型突变时,可能因表达水平不一而表现出不同的表型。因为表达水平的不同可能导致信号传递机制出现不同程度的激活,并可能影响蛋白间的相互作用。

最后,大多数转基因的表达对位置效应十分敏感。绝大多数的转基因的表达都受整合位点附近的染色体结构影响,一定程度上也可能单独或同时受到拷贝数量的影响。表现为低水平表达、不严格遵循所用启动子的特异性以及没有拷贝数依赖性等。不但宿主基因组的增强子可以影响转基因的表达特异性,DNA的甲基化也会弱化转基因表达,就连转基因表达的过程也出现渐进性减弱的特点。例如,β-珠蛋白基因调节元件控制的报告基因整合到红细胞系时,报告基因的活性随着细胞代数的增加呈逐渐减弱的趋势。由于这种变化可以被甲基化酶抑制剂如氮胞嘧啶(azacytitdine)所逆转,说明该过程与外源基因发生甲基化有关。

由此,不是所有含有同样转基因的动物都能表达相同水平的蛋白,因为每个品系小鼠在多个整合位点上所含有的外源基因拷贝数可能相差100倍。这种情况对于希望研究不同蛋白表达水平与表型间的关系是有用的。但有时候外源基因出现高水平表达,却没有生理效应,其结果是细胞的反应只是针对异常高表达的蛋白,而不是直接针对蛋白功能。如果表达的是突变蛋白,要明确是不是发生了上述情况,可以通过制备含有正常基因的转基因鼠,其表达水平等于或高于突变蛋白水平的方法来加以区分。如果这种调控无法实现,则从转基因品系而来的数据需要谨慎加以分析。

如果转基因整合后使得整合位点附近的某个内源性基因出现了失活,或影响到了周边基因的表达,则转基因动物会表现出与该编码基因无关的外部表型。由于这个原因,最好是用杂合子状态的转基因小鼠做研究,这样就能够利用其另一条野生型等位基因位点来挽救转基因导致的基因失活的问题。但即使这样,基因的剂量效应或者单倍体效应仍无法对整合位点附近被破坏的基因表达起到弥补作用,因此还是会影响其表型。

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