外源基因在基因组上整合的随机性可能导致类似于其他基因组修饰的非预期效果，即导致转基因沉默或者异位表达。此外，宿主细胞基因组对转入基因的重排可能会引起不完整或突变蛋白的过表达。这种现象在将大型载体导人基因组时显得更为突出，因为这些载体中的编码序列往往因整合时出现的随机断裂，造成转基因序列大跨度分散。基因敲除技术克服了随机整合的盲目性和偶然性，整合位点精确，基因表达水平高，是一种比较理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

它与传统的制备转基因方法不同的是：首先，敲除致突变是对原有基因进行改造，即使用一个突变基因替换野生型基因。这种替换可以实现对隐性突变型基因表型的分析，即此时如果存在野生型蛋白，则不会有基因敲除表型出现。其次，与随机插入转基因相比，它既能保持基因的表达模式和表达水平不变，且能使对周边基因的负效应降到最低。再次，虽然构建用于敲除致突变的载体耗时更多，但因其体内表达模式和水平都是生理性的，使用了内源性启动子，且能避免在体筛查表达突变基因动物的过程，从而极大地促进了对基因的分析。

常规的制备基因敲除小鼠的步骤可以分为5个步骤：①载体构建；②ESC的获得；③ESC基因敲除和筛选；④ESC囊胚移植；⑤基因敲除小鼠鉴定。