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DNA转化方法

2016年03月23日来源：生物帮作者：生物帮责任编辑：wlladmin

摘要：受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。

2.40.1 受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。

2.40.2 感受态细胞的制备

(1) 将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

(2) 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

(3) 弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

(4) 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

2.40.3 转化

(1) 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

(2) 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

(3) 42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

(4) 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

(5) 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

(6) 同时做两个对照:

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

2.40.4 计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

(1) 转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积；

(2) 转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)；

(3) 感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数。

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