RSS订阅

实验攻略

基因修饰小鼠可诱导表达系统

2016年03月28日 浏览量: 评论(0) 来源:《基因修饰小鼠制备常用技术》 作者:王超主编 责任编辑:wlladmin
摘要:基因修饰小鼠可诱导表达系统

有许多基因在胚胎发育到成年期表现不同的功能,这就需要对基因的功能分时段进行研究。有时候,为了对基因功能进行更精细的分析,还需要对基因的活性进行调节,此时,利用可诱导表达的SSR体系,不仅可在特定的细胞系(空间调控),也可在特定的时间(时间调控)来完成。理想的状况是,基因修饰能够实现在特定组织和指定时间的即时表达,且控制基因表达的开关是可逆的,基因的表达量是可控的。

然而,前已述及,Cre的过量表达对细胞有毒性作用。为了减少Cre重组酶毒性,研究人员想到了各种方案。首先,采用病毒介导Cre基因瞬时表达制备条件基因敲除通过控制重组酶的表达时间,只要表达足够量的Cre用以介导LoxP锚定的靶基因的重组就可降低Cre毒性,但Cre基因的表达调控不太精确。此外,病毒感染可能会引起并发症而干扰小鼠表型分析。其次是应用自我切除型Cre表达载体从而终结自身的表达。特点是用突变的LoxP位点锚定Cre表达框,用野生型的LoxP位点锚定靶基因,可以使Cre介导自身切除的效率低于靶基因的切除,从而保证Cre表达后能有时间完成靶基因重组后实现自身切除。

其次,使用具有核定位信号序列(NLS)的可透膜的Cre重组酶,直接注射到靶组织,控制作用时间也可以实现重组。特点是简单易行且在非增殖终末分化细胞中也可实现重组。缺点是Cre重组酶介导发生重组的细胞所占比例较少。

最后,可诱导的Cre表达系统。主要包括I型干扰素系统、四环素系统、他莫西芬系统等,能改变常规Cre介导的一次性的不可逆重组过程,实现Cre的时空特异性调控,减少细胞中Cre重组酶的作用时间。在基因修饰动物模型制备中用到的诱导型载体的设计主要取决于启动子,如高温诱导的热休克蛋白启动子,重金属、干扰素或糖皮质激素诱导的启动子等。但这些启动子一则不具备组织特异性和时间上的可控性,在非诱导条件下常出现“表达泄漏/本底表达”(即背景表达),再则这些诱导剂自身的理化毒性会对细胞造成损伤。1995年,Kohn等首次引入了通过可诱导表达Cre小鼠品系实现基因修饰的策略。而今对目的基因的时间性调控主要通过两种途径实现:①使用Cre-LoxP结合四环素依赖的调控系统(tetracvclin dependent regulatory system)。②使用仅当有外源诱导物时才发挥作用的Cre/Flp变异体系统实现。例如,将Cre和突变的雌激素受体(ER)的配体结合域基因融合后所构建的Cre-ER品系被广泛用于基因重组研究。这些系统的共同特点是,均巧妙地消除了组成性基因敲除所引发的严重的、甚至致死性表型等对后期基因功能分析有影响的因素的干扰。同时,也避免了动物出现生殖力低下、全身性机能紊乱或为了适应基因修饰而引发的代偿性反应,后者会掩盖基因敲除的表型特征。

点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息
Baidu
map