5.5.1  载体的导入方法

基因捕获载体可通过电转化或逆转录病毒感染法引入基因组。两种导入方法各有其优缺点，在实际应用中需综合运用。

(1)逆转录病毒有插入基因5′非翻译区或第一内含子的倾向，可能产生更高比例的功能失活(无义)突变。主要优点是能确保完整单拷贝载体插入基因组中，尽管电转化法通过优化可使多拷贝插入控制在20％以下。逆转录病毒载体有3个缺点：包装容量有限，可能产生逆转录病毒介导的基因沉默和报告基因异常表达。

(2)通过电转化导入质粒来源的载体通常显示为基因组内随机插入，更适用于产生等位基因系列。

5.5.2  重复捕获

有些基因比其他基因更容易被捕获，即用不同的捕获策略可能会捕获同一个基因。而应用每一种类型的载体捕获基因的数量总是有限的，因此，建议联合使用多种载体。建立国际公共数据库，报告所有已鉴定的基因捕获克隆，以“序列优先”原则，有助于避免同一基因被重复捕获的问题。

5.5.3  基因捕获表达分析

大规模基因捕获所获得的大量插入克隆不可能同时被分析鉴定，需要提供预筛选方案。由于内源基因的表达模式可被报告基因的表达模拟，这就为我们提供了一种筛选的标准。但是，β-半乳糖苷酶的mRNA转录本表达有时比内源性基因的表达更低。首先可能是因为捕获基因通常易受选择性剪接的影响。一个基因可编码产生几种mRNA转录本，在某些组织或细胞绕过含载体的内含子的拼接方式可导致产生野生型蛋白和β-半乳糖苷酶活性缺失。其次，基因捕获插入可能破坏某些组织中对基因活性必需的增强子元件，而组织特异性增强子可存在于内含子中。

因为不能保证捕获基因都会显示有意义的表达模式或突变克隆会出现明显表型，就有必要应用DNA阵列等技术进行体外预筛选，就可以减轻通过生殖系传递来筛查基因捕获的工作量。联合使用体内外两种筛选手段可能获得更客观全面的信息。

5.5.4  表型缺失

即使经过预筛选，有些突变克隆产生的小鼠系也没有明显表型。①可能是在绕过含载体的内含子的拼接增加时，就有足量的野生型蛋白产生并维持正常的功能。②可能是载体插入没有破坏基因，而产生减效等位基因或超等位基因。这些新产生的等位基因，可以用来研究因基因剔除致胚胎死亡基因的功能。③突变基因的功能可能由同一基因家族中的相关成员代偿，因而突变小鼠缺乏明显表型。

5.5.5  突变基因的克隆和序列测定

对内源基因的鉴定是整个研究过程中的主要瓶颈，到目前为止，只有少数突变克隆基因被鉴定(占克隆总数的比例很小)。多数基因捕获策略是依靠基于PCR技术分离融合于标记基因5′或3′末端的基因序列实现的。尽管快速扩增cDNA末端比较容易实现，但随后克隆及分析筛选能提供信息的cDNA却比较费时。高通量微分技术和对5′-RACE产物固相测序技术可实现自动化和荧光测序，有助于在生殖系传代前对突变进行基因鉴定和筛选。

5.5.6  突变的适应性

传统的基因捕获通常会产生功能失活(无义)突变，缺点是所造成的基因突变后果过于剧烈，而有时候若能产生不太严重的突变可能更有意义。为此，应用含LoxP位点的载体以更好地控制突变的性质，实现在捕获基因组条件性取代载体，产生更精细的突变，包括点突变和／或选择性表型标记等。

5.5.7  注意事项

(1)要避免固定液中的戊二醛的降解，可以在用前再加戊二醛。不含戊二醛的缓冲液可以在4℃保存(注意：戊二醛有毒)。

(2)对染色液过滤可以除去小颗粒。将染色缓冲液与X-Gal储存液在使用前1 h预混，且用前过滤。

(3)PCR产物不要过长(不超过1 kb)。要在1管中做2个PCR，野生型的产物与基因捕获产物间大小应有100 bp差别。

(4)离心后，混合物就被分离到离心管底的粉红色酚-氯仿相，中间界面是白色，上层是无色水相。RNA主要保留于水相中，体积大概是所加Trizol体积的60％。吸取水相时要特别小心，不要使留于中间相的DNA或者蛋白层污染RNA。要保留DNA和蛋白质，可以保留中间相。

(5)RNA的沉淀往往肉眼不可见。因此，要记住离心时管盖所处的位置，离心使沉淀抛向圆心的外侧。不要用枪头碰这一侧的离心管臂，以免带走RNA沉淀。

(6)不要用真空装置风干RNA，这样会降低其溶解度。

(7)一步法RT-PCR反应比常规方法要简单快捷得多。本方法成功率非常高，也不需要对引物和RNA浓度进行调整，非常省事。也可以使用市场上类似的试剂盒。

(8)电压与电极间的距离有关。一般是用最大5 V／cm的电压，可以进行调整以能清晰区分DNA片段为度。

(9)不要将样品在洗涤缓冲液中放置超过24 h，因为这样可能导致出现非特异性染色。要长期保存样品，加入固定缓冲液，用膜包裹并存储于4℃。

(10)避免在封固液中出现气泡，要一滴一滴地加，使其蔓延到载玻片的边沿，从同一个边沿放置盖玻片，使其自然滑落覆盖载玻片。可以用指甲油封片。

(11)要多次提取，则需要预先按照4：1的比例，提前2 h加入足够的提取和组织准备液。

(12)对Sigma的方案进行改进，可以将样品孵育在55℃，而不是室温，保持12 min而不是10 min，这样可以增加DNA的产量。

(13)要检测大于12 d胚胎中基因表达特点，就要做组织切片或者做冰冻切片。染色情况取决于样品的大小，这是因为不均一的底物渗透或者内源性β-乳糖酶活性不一致会干扰染色。这个原因同样适用于全器官染色。

(14)致密组织，如心脏、肾脏或者脾脏可以不用OCT包埋剂包埋，而直接冷冻固定在冰冻切片机的样品固定器上。长条状组织和中空组织，如大动脉，小肠或者乳腺需要预包埋。

(15)要透明胚胎或者器官，在洗涤和染色液中均加入0.01％的脱氧胆酸和0.02％的诺耐洗涤剂P-40。

(16)核快红，物如其名，将核染成红色，胞质为粉红色。该方法类似于组织学分析，且比HE染色要更加快捷和方便。

(17)不要使用水溶性封固剂，否则会将核快红洗掉。如果刚完成X-Gal染色，则可使用Mowiol。