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ELISA实验常用试剂详解
2016年03月30日
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：ELISA实验常用试剂详解
抗原和抗体
ELISA中用到的抗原可以是纯化的天然抗原、重组抗原、人工合成多肽、
小分子化合物等，天然的抗原具有天然的构象，保持了天然的免疫原特性，但
是一般来说纯化难度都很大，而且天然的抗原丰度都较低，获取难度非常大，
重组抗原相对制备比较容易，但是实验中难以避免引入工程菌菌体自身的蛋
白，如果纯化不好容易对实验造成干扰。人工合成多肽特异性较好，但是所含
的表位很少，仅能检测与其相对应的抗体的系统。另外由于多肽分子量小，而
且疏水性不是很强，所以包被难度较大，如果常规方法不能很好地包被则需要
考虑与载体蛋白相偶联然后再包被。
ELISA 中用到的抗体应该具有较强的亲和力和较高的特异性，而且一般
来讲纯度越高越好，推荐使用抗原亲和纯化（多抗）或使用Protein A，G 纯化
（单抗），减少目标抗体对实验的干扰。也有少数情况下直接用小鼠腹水包被
的。
包被
关于包被液的讲解请参考“将抗原或抗体吸附到固相载体上”一部份，
这里只简要给出几种包被液的配方。
(1) 50mM pH 9.6的碳酸盐缓冲液：
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.63g
加蒸馏水至1 L
(2) 20mM pH 8.5 的Tris-HCl
Tris 2.42g
加蒸馏水至1 L，用HCl调pH至8.5
(3) 10mM pH 7.2 PBS
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
加蒸馏水至1 L
封闭
封闭试剂一般都用PBST溶解，即在上述10mM pH 7.2 PBS的基础上
加入0.2% Tween-20即可。
抗原或抗体稀释液
抗原或抗体稀释液可以是PBS、PBST、封闭液、生理盐水等，理论上讲
封闭液是最理想的抗原或抗体稀释液，但有时候为了节省试剂和操作，PBS
作为稀释液应用更广泛。
酶标抗原或抗体
酶标抗原或抗体是ELISA中最重要的试剂，也是ELISA（酶联免疫吸附
测定）名称的由来原因。目前在ELISA 体系中可以引入的作为标记用的酶主
要有四种：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、ß-半乳糖苷酶（β
-Galactosidase,BG）、脲酶（Urease）。下表将它们各自的底物以及显色反应结
果一一列出。
HRP 酶最初从植物辣根中提取，它一共至少有七种同工酶，目前商业化
的HRP酶至少有一半以上是同功酶C，商业化的HRP酶活性一般都非常强，
其主要作用底物是过氧化氢（也可以作用于过氧化脲），但是高浓度的过氧化
氢对其活性有很强的抑制作用，因此在使用时过氧化氢的浓度非常关键。
（1） OPD（邻苯二胺）是早些年ELISA中最常用的底物，其工作浓度
一般为0.4mg/ml，底物缓冲液用0.1M pH 5.0 柠檬酸钠缓冲液。商业化的OPD
有预先称好质量的片剂，使用前直接溶解在指定体积的缓冲液中即可，OPD
体系中H2O2的浓度一般为0.004%
（2） TMB（3,3’,5,5’-四甲联苯胺）毒性低，而且颜色对比很明显，近
些年来非常受欢迎。其工作浓度从0.0005%-0.01%范围内都可以使用，实验中
一般使用其盐酸盐，因为其盐酸盐的溶解性比其本身溶解性强。TMB 底物体
系中过氧化氢的浓度也在0.004%左右比较合适。其底物缓冲液一般使用0.1M
pH 5.0 柠檬酸钠缓冲液或0.1 M pH 5.6醋酸盐缓冲液。
（3） ABTS（2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）使用的工作浓度
也为0.4mg/ml，系统中过氧化氢浓度在0.002%左右适宜。底物缓冲液一般用
0.1 M pH 4.0 磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液。ABTS也有商业化的片剂销售。
（4） 5-氨基水杨酸灵敏度较差，现在基本已不用。
（5） DAB（二氨基联苯胺）底物的终产物为棕色沉淀，不方便用酶标
仪进行判读结果，所以在ELISA中应用较少，但在Western Blot 中应用较多，
其使用浓度一般在0.5mg/ml，过氧化氢使用浓度为0.02%，底物缓冲液用pH 7.4
PBS或者Tris-HCl。
碱性磷酸酶源于牛小肠或大肠杆菌，不同来源的碱性磷酸酶使用的缓冲液也不
一样。对于大肠杆菌来源的碱性磷酸酶，其缓冲液一般用0.1M pH 8.1 Tirs，
含 0.01% MgCl2。对于小肠来源的碱性磷酸酶，其缓冲液一般用pH 9.8 的10%
二乙醇胺（含0.5mM MgCl2）。其底物对硝基苯酚磷酸盐（PNPP）工作浓度
一般为1mg/ml，反应结束后用0.1倍体积的2M碳酸钠终止反应。
ß-半乳糖苷酶底物是ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷），其使用浓度
一般为0.7mg/ml，底物缓冲液用0.1 M pH7.0 磷酸氢二钾缓冲液，并包含1mM
MgCl2和0.01 M 2-巯基乙醇，反应结束后用0.25倍体积的2M碳酸钠终止反
应。
脲酶底物尿素可被脲酶分解释放出氨，使pH 升高，溴甲酚紫在弱酸性条
件(pH 4.8)条件下显黄色，随着反应的pH 升高，其颜色变为紫色。反应完后
每孔用10ul硫柳汞终止。
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