目的： 构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。

方法： 合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中获得pAdTrack-siRaf-1质粒,PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siRaf-1质粒,后转染HEK293细胞,包装获得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒,继而感染原代培养的心肌细胞,通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液体闪烁计数仪测定³H-亮氨酸([³H]-leu)掺入率,用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。

结果： 重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang Ⅱ诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[³H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。

结论： 成功构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达,抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

全文阅读：Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响