摘要:为研究社会隔离能否导致雌性啮齿动物产生焦虑，将成年雌性大鼠分别进行单独隔离饲养(单养)和四只一笼群养，十周后进行行为学和生理测试。行为结果显示:与群养组相比，单养组大鼠在旷场中的直立次数减少，明暗箱测试中的暗箱停留时间增长，穿越次数减少;说明长期社会隔离使雌鼠产生了焦虑。虽然两组大鼠与应激和生殖相关的生理器官重量没有差异，但单养组血清皮质醇和孕酮水平比群养组低，说明长期社会隔离导致雌鼠下丘脑唾体一肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴的调节异常，可能会对雌鼠的生殖生理带来不利影响。

关键词:社群隔离;雌性大鼠;焦虑行为;血液激素;生理指标

正常的社会关系对生物个体的健康有着重要意义，一旦遭到破坏将对机体带来消极影响。长期社会隔离对群居动物来说是一种生存应激。这种应激模型为研究人类精神疾病提供了很好的切入点，被广泛用于人类精神障碍疾病的发病机制、新药研发和预防等的研究。

社会隔离能使群居动物脑的形态、激素水平以及神经化学通路发生改变，进而使该动物表现出异常的行为和生理特征。以往研究发现长期社会隔离会导致啮齿动物多动，攻击行为增加困，在新环境中缺乏正常的习惯化行为，前脉冲抑制(prepulse inhibition, PPI)缺失等。然而，社会隔离对啮齿动物的影响受到很多因素的制约，与被测动物的性别年龄、品系以及隔离持续的时间均有关系。例如，社会隔离能使成年的雌性小鼠(M。musculus)'肾上腺肥大，动情周期缩短，使成年雌性大仓鼠(Tscheskia triton)的卵巢和子宫增大，但是对雄性大鼠(Rattus norvegicus )、雄性小鼠(Musmusculus)}和成熟的大仓鼠则没有影响;3周龄的雄性bong Evan大鼠隔离12周可以增加其对酒精的偏好，但是在成年期进行隔离则不会出现此现象,最近的研究表明短期隔离或者每天隔离1h，持续四周会导致草原田鼠血清皮质酮显著升高;但是长期隔离四周则对血清皮质酮没有影响

社会隔离能否使鼠类产生胁迫和应激反应，与鼠类在自然条件下的生活方式也有密切关系少〕。研究表明单养对大鼠、小鼠和长爪沙鼠( Merionesunguiculatus)等群居动物会产生胁迫效应，引起焦虑反应而对营独居生活的金仓鼠(Mesocricetus auratus)和大仓鼠则是有利的关于社会隔离对大鼠应激反应的影响研究尚存在争议，比如有些研究发现社会隔离引起大鼠血清中促肾上腺皮质激素(Adreno-('.orticotropic Hormone,ACTH)和皮质酮的升高ya.zz爪有些研究中则是降低，还有些研究发现ACTH和皮质酮的水平在群养和隔离饲养动物之间差异不显著

在本研究中，我们将以成年雌性大鼠为研究对象，一定条件下，雌性的应激反应明显高于雄性大鼠，但以往的社会隔离研究用雄鼠比较多，采用高架十字迷宫(elevated plus maze,  EPM)旷场(open field)和明暗箱(light/dark box) 3种经典的焦虑测试方法来检测长期社会隔离(隔离l0周)能否引起雌性大鼠的焦虑反应;皮质醇、孕酮、雌二醇等激素水平与群养组大鼠是否存在差别;应激、生殖相关的肾上腺、脾脏、子宫、卵巢、包皮腺等器官重量是否发生了变化。本研究将有助于进一步加深人类对啮齿类动物社会隔离焦虑模型的理解。 

1材料与方法

1.1 动物

24只2个月龄成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始体重(196.3 ^-242. 6 g)，购买于北京维通牙日华实验动物技术有限公司。考虑到雌性SD大鼠是褐家鼠的变种，在野外属于群养动物，在实验前，4只雌鼠同笼饲养，买回后适应1周;每天进行阴道分泌物的涂片，观察动情周期的变化，选择有正常动情周期的大鼠进行后续实验。饲养大鼠的房间的光暗周期是14I, / lOD，光周期逆转(早晨08:00关灯，22:00亮灯)，室温控制在(22士2)0C。整个实

验期间，供给充足的食物和水，食物为标准大鼠饲料。实验时，我们随机将24只雌鼠分为两组，其中12只四只同笼饲养，作为群养组，其他12只单笼饲养，作为社会隔离组。标准大鼠塑料饲养笼(37 cmX 26 cmX 17 cm)内连续饲养10周。

为了排除动情对行为和激素结果的影响，我们只选用非动情期大鼠的数据进行统计分析。为了避免人为因素对大鼠行为和激素水平的影响，我们在大鼠的行为测试和取血样之后检查其阴道分泌物涂片，确定其动情状态。动情期大鼠阴道分泌物全部是无核角质化细胞或间有少量上皮细胞。

1. 2行为测试

所有的行为测试都是在光线较暗的安静的房间进行。测试时间为9:30-16:30(大鼠光周期的暗相)。行为测试时，按照高架十字迷宫、旷场和明暗箱的顺序依次测定，每只鼠每天只进行一次测试。

1. 2. 1高架十字迷宫 高架十字迷宫由上海欣软信息科技有限公司提供，包括两个开放臂(45 cm X 10 cm)、两个封闭臂(45 cm X 10 cm X40 cm)以及10 cm X 10 cm的中心区域，封闭臂和开放臂交叉呈十字形，整个迷宫距离地而74 cm。被测大鼠在测试前先在测试的房间中适应30 min,测试时有正常的灯光照明。将被测大鼠放在中心区域(头朝向开放臂)，让其自由探索5 min。每只大鼠在迷宫中的活动情况由摄像机拍摄记录，然后由对实验处理不知情者对录像进行观察，统计动物进入开放臂和封闭臂的次数(四肢均进入臂内)，以及分别在开放臂和封闭臂内停留的总时间。

1.2.2旷场   旷场由上海欣软信息科技有限公司提供，大小为75 cmX 45 cmX 35cm的有机玻璃制成的箱子(无盖)，将其底板平均划分成15个15 cm X 15 cm的格子，中间的3个方格称为中央格。实验开始时，将被测鼠轻轻放在旷场一角的格子中(朝向角落)，让其自由探测10 min，摄像机记录其在此时间段内的所有行为。统计的指标如下:水平运动能力(所穿越的格子数)、直立次数(后肢站立，前爪腾空或扶趴旷场壁的次数)、中心时间(在中心格中停留的时间)以及潜伏期(从放入到第一次离开角落格子的时间)和休息时间(四肢站立不动)。

1.2.3明暗箱  明暗箱由上海欣软信息科技有限公司提供，由两个规格为35 cm X 25cm X 17 cm的塑料箱组成，中间通过锡铁皮管(长5cm，直径为5. 5 cm)相连。其中一箱用透明的有机玻璃板覆盖，并在盒盖上方30 cm处放置40 W的灯泡提高亮度，作为明箱;另一箱则用硬纸板密封，阻比光线进入，作为暗箱。测试时，将待测鼠放入明箱的中心区域，任其在明箱和暗箱中自由探究5min。所统计的参数包括:潜伏期(从放入到第一次离开明箱所需要的时间)，明箱中累积时间、暗箱中累积时间(四肢均进入时，认为是进入)和两箱之间的穿越频次。

每只动物测试完毕，实验人员都对所使用的迷宫进行擦拭清洗(先用75%的酒精，然后用水)，并用吹风机吹干，以避免前一只大鼠的遗留气味影响之后待测大鼠的焦虑行为水平。

1. 3器官解剖和血液激素的测定

处理10周后，在上午9: 30-10: 00，采用断头的方法处死两组试验鼠,3 min内收集躯干血。血样在4 000 r/min, 4℃下离心30 min，取得血清。将血清保存在一2 0 0C，以备进行皮质醇、孕酮和雌二醇的测定。然后，解剖大鼠的肾上腺、脾脏、卵巢、子宫和包皮腺并称重，精确到0. 1 mg。相对器官重量通过下而的公式计算相对器官重一绝对器官重(g) X100/体重(g) 0血清样品的激素含量采用Iz} 1放射性免疫测定的方法进行测定。激素测定所用的试剂盒均由北京科美东雅生物技术有限公司提供。人类的抗血清具有高度特异性;对所有标准的激素来说，人类抗血清与其他的类固醇激素发生交叉反应的可能性小于0.0100;内部和相互反应的可变性小于7. 4%和10. 0%。

1. 4数据分析

首先要采用单样本KS检验法对所测得的数据进行正态性检验。对于正态分布的数据，采用双尾独立样本T检验;对于非正态分布的数据，则采用Mann Whitney U检验进行统计分析。所有数据都用SPSS 18. 0进行统计分析，显著水平定为a=0. 05。

2结果

2 .1高架迷宫实验

隔离饲养和群养大鼠在高架十字迷宫测试中的行为没有表现出显著差异

2. 2旷场实验

与四只一笼的群养雌鼠相比，单养的雌鼠在旷场中直立次数明显减((t=2.543,P=0.023)，其他行为没有显著差异。中间格子的停留时间是情绪的重要指标，虽然从平均值来看，两者有较大差别，但数据是非正态分布，采用Mann Whitney U检验进行统计分析，结果显示群养组和单养组之间并没有显著差异(二=0.221,P=0.833)

2. 3明暗箱实验

与群养的雌性大鼠相比留时间显著增多(Ct= 2. 520,留时间显著减少(Ct一2. 524,，单养雌鼠在暗箱中停P = 0. 047)，明箱中停P = 0. 045)，在明暗箱之间穿越次数明显减少(总穿越频次:t = 2. 114,P=0. 049)，潜伏期没有差异(二=1.629,P=0.103)。 

2. 4体重和器官重量变化

单养和群养雌性大鼠的试验前初始体重没有显著差异((t=1.290,P=0.210)，但隔离饲养

第1周后，与群养组大鼠相比，单养组大鼠表现出明显的体重增加(t=2. 570,P=0. 023)，这种

差异一直持续到隔离饲养的第10周(t=2. 900,P=0 .050)。

然而，单养和群养雌鼠之间肾上腺、脾脏、子宫、卵巢和包皮腺的相对重量并没有表现出显著差异

我们的研究结果表明长期社会隔离使雌性大鼠在旷场中的直立行为减少，在明暗箱测试中，明箱和暗箱之间穿越次数减少，并在暗箱中停留时间增加，说明雌性大鼠在长期社会隔离中产生了焦虑行为。这与有些早期的研究结果一致。但Helleman与Zha等的研究结果却表明社会隔离并没有使大鼠产生焦虑反应。这种差异原因可能是实验动物品系、性别差异及实施隔离的时间不同引起的。比如，Hellemans用的是雄性I, Evan大鼠，而本实验选用的是雌性SD品系的大鼠;Hellemans选择在Long-evans大鼠21d和66d

时进行隔离，共隔离饲养了3个月，Zhao是在SD大鼠21天时实施的隔离，共隔离饲养了8周，而本实验则是在SD大鼠成年的时候进行的隔离，共隔离饲养了10周。根据以前文献报道，社会胁迫通常会减少动物在高架迷宫中开放臂停留的时间X33 3d}但令人费解的是，在高架十字迷宫测试中，我们并没有观察到隔离大鼠和群养大鼠在行为上的差异。这可能由于高架十字迷宫中的行为参数比较容易受到各种不确定测试因素的影响所致，3}};但也可能由于成年SLl雌性大鼠对旷场和明暗箱测试更加敏感，具体原因还有待进一步的验证。

体重方而，我们发现与群养大鼠相比，社会隔离仅一周就能使雌性大鼠的体重显著增加。这可能是因为隔离饲养的大鼠比群养的大鼠进食量更大，有研究表明，即使己经饱食的隔离饲养大鼠仍然表现出取食行为。另一方而，体重的增加(肥胖)也是判断啮齿动物产生社会胁迫的一个重要指标

除了体重增加之外，应激、生殖器官重量及相关激素水平的变化也是动物产生胁迫反应比较直观的测量指标[?17。但在我们的试验中，群养组与单养组的肾上腺、脾脏、子宫、卵巢、包皮腺的相对重量并没有表现出差异。这可能是因为称量器官湿重很容易受到血液含量及附带组织的干扰。激素的研究结果表明社会隔离使血清中皮质醇和孕酮降低，表明社会隔离导致了雌鼠下丘脑唾体一肾上腺轴和下丘脑-垂体Jh}腺轴的调节异常，可能会影响到隔离鼠的代谢、繁殖和免疫等生理功能。我们虽然发现社会隔离使雌性大鼠出现了明显的焦虑行为，但皮质醇却显著下降，这种行为和激素水平不一致的现象，以往研究中也有出现，比如:高热应激使大鼠焦虑，然而血清皮质酮的水平却下降.当糖皮质激素水平是正常的时候，大鼠也常会出现各种焦虑行为口;创伤后应激会导致行为和神经活动的改变，但尿液中皮质醇水平却降低比〕。这或许是因为焦虑行为和激素水平测试的结果非常依赖动物的饲养条件(活动空间大小、饲料)、测试环境及选择的测试方法(依靠单一行为方法无法准确推断实验动物的焦虑水平);还有可能由于动物对长时期的应激刺激产生了适应;另外，雌性大鼠的激素水平可能与其所处的动情周期也有关系。

4结论

本文研究结果表明，社会隔离使雌性成年大鼠产生了焦虑行为，并引起隔离大鼠血液中皮质醇和孕酮的下降;动物长期进化过程中形成的独居或居的生活方式是决定动物驯化过程中适宜养殖条件的重要因素，人为改变其生活模式可能会对其行为和生理产生影响。此研究结果将有助于进一步加深人类对啮齿类动物社会隔离焦虑模型的理解。本研究的局限性在于激素和行为的检测虽然排除了动情期大鼠，但没有认真区分其他动情周期比如动情间期、动情前期和动情后期之间的差别。社会隔离对处于不同动情状态雌鼠的影响尚需要进一步研究。

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