为了敲除斑马鱼胚胎中的一个基因，哈佛大学的发育生物学家Alexander Schier使用了基因组编辑系统CRISPR。但是Schier最终却不仅仅只是敲除了一个基因。他和他的同事们设计了一种新的方法在发育动物体内标记和追踪细胞。研究结果26日在线发表在《Science》杂志上，研究人员使用CRISPR诱导形成的突变揭示了一个惊人的发现：成年斑马鱼体内很多组织和器官的形成仅源自一小部分的胚胎细胞。

一些研究人员已经开始尝试使用这种方法探究发育过程。伦敦科瑞克研究所的发育生物学家James Briscoe将这种方法称作“CRISPR技术的创新应用”，他说，“这项技术可以帮助我们重构组成一个动物机体的所有细胞的‘家谱’。”一些科学家打算利用这种方法追踪肿瘤的进化。一些人正在开发类似的方法使用CRISPR记录细胞的历史，例如细胞受到的环境影响。

GESTALT新技术：构建动物机体所有细胞的‘家谱’

Schier和他的同事们利用了被哈佛大学遗传学家George Church称作的CRISPR的“基因组破坏”能力。正常的CRISPR编辑中，一个被称作向导RNA的分子会准确的将Cas9酶引向基因组特定位点，然后切断该处的双链DNA。而模板DNA可以指导细胞修复双链断裂，可使编辑的准确性达到单核苷酸改变的水平。但是如果科学家不提供模板链，细胞就无法准确的修复断裂，最终基因就会形成一个“疤痕”，在该处可能出现核苷酸丢失或者插入。

为了确保目标斑马鱼基因真的被敲除，Schier引入了几种不同的向导RNA用于靶向该基因的多个位点。但是几次重复实验的结果差异非常大：缺失的大小不同，而且基因疤痕区域会出现小型和大型的插入。Schier和华盛顿大学的遗传学家Jay Shendure意识到，可以进一步利用这种基因破坏的多样性。

Schier和Shendure在斑马鱼胚胎的基因组中插入了一套外源DNA，包含了10种不同的CRISPR靶向序列。然后他们将Cas9酶和10个与靶向序列对应的向导RNA注入单细胞胚胎中。随着胚胎发育，每个细胞中CRISPR系统会多次破坏目标DNA，将其标记上一种条形码（存在独特的缺失或者插入）。当细胞分裂时，子细胞一开始会携带有相同的条形码标签，然后经过Cas9在不同位置切割后出现不同变化。条形码第一次出现变化应该是发生在二细胞期，编辑工具在约4小时后就会慢慢失效，此时胚胎中含有成千上万个细胞，在此之后，保留下的条形码将会随着细胞的不断增殖出现在成年动物体内。

4个月后，科学家们收集了成年斑马鱼的器官，并从约20万细胞中分离出了超过1000种不同的条形码。含有相似条形码的细胞很可能在发育晚期分裂形成，因此科学家们能够使用计算机程序计算这20万个细胞的家谱，即用一张谱系图揭示每个细胞产生自何处。

最惊人的发现之一是，所有器官中大量组织都是由少数细胞产生的。大多数器官中，超过一半的细胞共享不到7种条形码。除了脑以外的所有器官中，25种不同的条形码组成了超过90%的细胞。Briscoe说，“组成组织的细胞群可能比我预期的还要少。”

对发育生物学家而言，这项称作GESTALT（Genome Editing of Synthetic Target Arrays for Lineage Tracing）的新技术可以帮助理解动物是如何从单个细胞形成的。它同样还能帮助我们阐明癌症研究中的一些重要问题，例如多少前体细胞会产生肿瘤，肿瘤中的细胞是如何相互关联的，以及扩散的癌症细胞是如何与最初的肿瘤相关联的。

Schier表示，这项技术也有些不足。例如，它无法可靠地标记每一个新一代的细胞。但是与其他追踪细胞和其后代的方法（例如染色方法或者依赖于自然突变）相比，利用CRSIPR产生的条形码标记进行追踪分析会更加有效，也更容易使用。波士顿儿童医院干细胞项目负责人Leonard Zon说，“我认为癌症生物学家会开始考虑使用这种方法研究癌症，因为与我们现有方法相比，这种标记细胞的方法会更加简约。我们当然想要尝试一下。”

另一种mSCRIBE系统：记录细胞经历的环境影响

研究人员已经提出其他方法将CRISPR转变成一种细胞记忆。Schier说，“我认为从概念上来讲这是最令人兴奋的事情，你可以在DNA中记录历史。”来自麻省理工学院的研究小组已经进行了这项研究。上周，Timothy Lu和他的同事们将一篇文章上传到预印本网站bioRxiv.org上，文中描述了一种称作mSCRIBE （mammalian Synthetic Cellular Recorder Integrating Biological Events）的系统。不同于加入含有10种CRSIPR靶向序列的条形码，研究人员向细胞中插入了单个CRISPR靶向序列并改造了位点使其能编码向导RNA。最终该系统靶向自身：向导RNA引导Cas9到达其来源DNA，Cas9破坏DNA，导致序列中产生突变，最终生成一种含有突变的向导RNA。突变的向导RNA进一步引导Cas9到改变的靶序列上，然后不断的循环这个过程，期间DNA序列和向导RNA也不断的变化。

通过研究在成千上万的单细胞中CRISPR靶向序列是如何改变的，研究人员估算了Cas9需运行几轮才能产生特定序列（这个过程就好比在一个传话游戏中，需要多少轮才能将初始短语“lobster boil”转换成“losing team”）。在接下来的实验中，他们将Cas9靶向基因的活性与细胞中一条炎症通路的活性偶联起来。在接触到更多炎症因子TNFα的细胞中，靶向序列上会记录更多轮的Cas9造成的变异。

然后他们在小鼠体内测试了该CRISPR记录工具，将改造细胞注入动物体内，并在一些细胞中注入炎症诱发分子。在注入了这些分子的小鼠中，CRIPR靶向序列发生的改变比未处理的小鼠多。作者写道，这种方法可以应用于体内，以一种模拟方式记录生理相关的生物信号。

Lu和同事建议说，这种方法同样可以记录肿瘤微环境中癌症细胞受到的刺激因素，或者追踪疾病发生过程中细胞中特定通路的活性。Church表示这种方法在大脑研究中同样非常有价值，例如记录参与基础记忆的通路的活性。他说，“利用这种方法，你可以将一个瞬时过程转变成永久性记录，呈现在大脑每个神经元细胞中。”

参考文献：Wholeorganism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science26 May 2016:
DOI: 10.1126/science.aaf7907