摘要:   自2011年底以来，在华北与地区疑似犬狂犬病病与猪伪狂犬病疫情上升。但犬伪狂犬病病毒（PRV）感染发病在中国知之甚少。在这项研究中，我们研究了犬狂犬病的发病机制。

 

方法:   2011-2013在北京对13条犬死于自然感染PRV的病理变化进行评估。对健康成年犬进行分离PRV病毒BJ-YT株皮下注射实验。犬的组织进行肉眼和显微镜检查和免疫组化分析和犬的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）测定。

 

结果:  自然和实验条件下PRV感染的犬 ，全身性出血和/或充血是最明显的病理变化。主要病变两心内膜和外膜出现瘀点和瘀斑在二尖瓣瓣膜血栓、肺和胸腺出血和脾不完全收缩。在显微镜下，主要的组织病理学表现为全身性出血和充血，非化脓性神经炎（在实验感染犬出现，未观察到在自然PRV感染的犬）。脑干脑炎（自然感染的犬），心肌坏死或渗出，许多淋巴结及器官和组织的淋巴损耗。在脑干和感染犬外周神经节检测到病毒抗原。实验PRV感染有心肌病变的犬血清心肌肌钙蛋白（cTn-I）明显高于无心肌病变的犬。

 

结论:   基于这些结果，我们得出这样的结论：病毒引起的全身出血，外周神经系统病理和/或心脏损伤可单独或共同导致PRV感染犬的死亡。疾病的呼吸道症状是由于心源性病变。

 

 

背景:   伪狂犬病（也被称为"伪狂犬病"）是一种由伪狂犬病毒引起的急性、致命的疾病，属于病毒属，在α疱疹病毒亚科亚科疱疹病。猪是主要的PRV宿主，但许多哺乳动物也容易受到感染。认为犬（牧羊犬和伴侣犬），可以通过食用被污染的生猪肉或内脏感染这种病毒。犬狂犬病的临床表现不同于那些猪伪狂犬病。犬初期出现局部皮肤瘙痒，潜伏时间为2-9天。大多数感染的犬出现症状在48小时内死亡。犬的临床症状相似，包括面部皮肤瘙痒、呼吸困难、呕吐、出血性腹泻、水肿、共济失调、肌肉痉挛。然而，一些犬死了没有显示任何典型的症状。犬感染PRV病毒的组织学病变报道很少，组织病理学的研究一直局限于心脏和神经系统。然而，犬PRV感染系统的病理特点不是很好理解。不论什么原因导致心肌细胞死亡或损伤后，心肌肌钙蛋白-I（cTn-I）是一种心肌检测标志物。在损伤数小时内，cTn-I从受伤的心肌细胞释放到循环中，在2 d内达到峰，是随着损伤的持续而不断升高。血清增加的CTn-I可以持续的有效地被检测、监测和量化来评估心肌损伤。

 

自2011年初以来，在中国北方养猪场PRV感染的发病率增加，包括以前接种PRV的猪之间也有发病。这一疫情已波及九多个省、市，包括北京。这个的猪伪狂犬病爆发期间，犬PRV感染发生率同时增加。总的来说，13例犬狂犬病在我们的实验室被检测，包括来自农村地区和北京的城市地区农场的犬和宠物犬。对这13个自然PRV感染犬的病理变化进行了研究，提供了一个更新的系统的PRV病理特点。我们还进行了一个实验性的研究中，犬在实验室条件下感染PRV分离BJ-YT株探讨犬感染PRV的发病机制。

 

结果:   自然感染PRV犬  通过PCR，免疫组化，证实病毒分离，和兔接种试验来证实PRV感染。犬出现瘙痒（13 /13，100%），进行性加重的呼吸急促、困难（11/13、85%），唾液分泌过多（10／13，77%）、呕血（4 /13，31%）、震颤（4 /13，31%）和呕吐（2/13、15%）。，胸部平片观察（4 / 4，100%）没有明显的异常。9/13（69%）犬有吃生猪肉或内脏的历史。

 

总异常记录在尸检报告中，心脏畸形（11/13、85%）通常包括心外膜出血(5/13, 38%，Figure 1A)心内膜出血(9/13, 69%; Figure 1B)，心脏出血(3/13, 23%; Figure 1C)，心脏血栓(3/13, 23%).局灶性肺出血和/或充血(11/13, 85%; Figure 1D) 是呼吸系统中最常见的表现，一只犬肺气道出现泡沫流体。胃出血(6/9, 67%; Figure 1E) 脾的病理特别均匀，其特征是由众多的深红色到黑色，凸起，柔软，充满各种大小的出血区域 (9/13, 100% ；Figure 1F) 胸腺出血（11/11、100%；两只犬被排除，因为他们的年龄意味着他们的胸腺是无效的；Figure 1G）肾出血（2 / 13，15%）也观察到。其他肉眼病变包括皮下水肿（2 / 13，15%）和胸腔出血（1 / 13，8%）。因为对犬PRV的了解和以往的经验文献是有限的，只有来自13只犬的一些组织显微镜检查。脑干病变是最重要的。在脑干观察到非化脓性脑炎（8 / 8，100%；图1H）由轻度到重度血管周围袖套，和胶质增生和噬神经细胞现象。大脑和小脑的病变是有限的，只有轻度充血（1/5；20%）。轻度和重度出血炎症，嗜酸性纤维状的间质渗出（3 / 6，50%；图1J）是最明显的心脏改变。也观察到中度至重度肺水肿、充血、出血和/或（3/3、100%；图1K）.在肝脏的病理变化包括轻度至重度充血（6 / 6，100%）和局灶性坏死（3 / 6，50%）。胸腺显示弥漫性中度至重度出血（6 / 6，100%）和淋巴耗尽（3 / 6，50%）。还观察到不完全收缩的脾脏（3 / 4，75%）。淋巴结显示淋巴耗尽（4 / 4，100%）和出血（2 / 4，50%）。急性肾炎是典型症状，由中度至重度间质性充血（5 / 5，100%）和蛋白液积累在肾小管和胶囊（3 / 5，80%）。

 

实验条件下PRV感染犬:   实验条件下对五只犬接种PRV，潜伏期为87～93小时。所有受感染的犬在发病后31小时内死亡。所有的犬表现出抑郁、厌食、皮肤瘙痒、发声。注射区域一个激烈的，局部的瘙痒持续直到死亡，所有受感染的犬的皮肤出现自我诱导的创伤。小便失禁（3 / 5），进行性呼吸急促加重、晚期呼吸困难（2／5），唾液分泌过多（1 / 5）。对照组在研究期间没有发现异常。

 

大体病理学:   在实验组中， 5号犬在濒死的阶段在感染后第四天（DPI）被静脉麻醉安乐死，而其他四只犬在第五天出现濒死状态时被处死。在PRV感染组所有犬被处死后，将控制组的犬处死。对五只PRV感染犬中的三只进行宏观的心脏病变观察。这两个犬（NOS1和2）均有不同程度的心外膜和心内膜瘀点（图2A）和瘀斑（图2B）。两只犬（NOS1的和3）显示二尖瓣出血（图2C）。一条犬的二尖瓣出现出血。在两条犬的肺里观察到出血斑 (Nos 1 和2; Figure 2D)。一感染犬出现胃黏膜弥漫性深红色变色现象。十二指肠（3 / 5图2E）和空肠（3 / 5）呈现局灶性或弥漫性黏膜发红。脾脏发现暗红凸起区域（4 / 5；图2F）。实验组出现下颚皮下水肿（1/5）和明显的腹膜腔腹水。从实验组的其他器官或组织样本中无明显肉眼病变。对照组中无明显肉眼病变。

 

组织病理学检查:  PRV感染组，中度至重度，非化脓神经炎，以星状神经节中多灶性坏死，胶质细胞增生和嗜神经现象（5/5; Figure 3A），出血（4 / 5；图3b），和嗜酸性核内包涵体（2 / 5；图3c）为特征。非化脓性神经炎也在腹腔神经节观察到（1 / 5）。PRV病毒感染的三条犬（NOS 1，2，5）电镜下观察到心肌病变。两只犬观察到广泛心肌出血和坏死灶（图3D）受影响的心肌细胞胞浆出现肿胀，沉积、嗜酸性颗粒深染。坏死的心肌细胞丧失了横纹变得支离破碎。这五条犬中没有轻微的炎症反应。一只犬（5号）在心肌间质积累渗出嗜酸性粒细胞的纤维样分泌物(Figure 3E)。虽然没有观察到出血。四条PRV病毒感染的犬表现出轻度至中度肺淤血。在1条犬肺中观察到红细胞和血浆蛋白渗出（2号；图3f）。由伪狂犬病毒感染犬消化道最常见的观察有：在小肠中轻度至中度充血，在回肠（3 / 5；图3G）和结肠（4 / 5）淋巴结节出现轻度淋巴细胞耗竭。在回肠（3 / 5），盲肠（2 / 5；图3）淋巴结节轻度出血。在一条伪狂犬病毒感染的犬中观察到胃粘膜坏死。PRV感染犬的脾脏显示中度至重度不完全收缩。虽然PRV干预组织是正常的，不完全收缩的软组织充满了血液，收缩的脾红髓没有血液。胸腺轻度至中度出血 (4/5; Figure 3I) 。相对于对照组出现明显的淋巴细胞耗竭（4 / 5；图3j）。下颌淋巴结显示轻度出血（4 / 5）肠系膜淋巴结表现为淋巴耗竭（5 / 5；图3K）。PRV感染犬的肾上腺内皮层出现轻度至中度出血（束状带和网状带）（5 / 5；图3）。在PRV感染组其他器官或组织样本中无组织病理学异常。对照组无明显病变。

 

组织化学:  免疫组织化学染色证实神经系统中的神经元感染PRV。在脑干（4 / 5；图4a），颈部脊髓（2／5；图4b），星状神经节（5 / 5；图4c），腹腔神经节（5 / 5；图4d），和肠系膜后神经节（4 / 5；图4E）检测到PRV抗原。在其他组织或器官中没有检测到病毒抗原。

 

cTn-I分析:  探讨心脏病变和呼吸道症状之间的潜在关系， PRV感染犬的死亡及评价实验动物的血清cTn-I浓度。三条感染PRV有心肌损伤的犬（II组； 1，2，5）显示cTn-I增加，而无心肌损伤感染组（3和4；）和对照组（C组）血清cTn-I浓度仅显示轻微的波动（图5）。

 

讨论:  在自然条件和实验条件PRV感染犬全身性出血是最突出的病理发现，虽然在实验条件下PRV感染犬的许多组织和器官的出血是低于自然感染PRV的犬。这一结果表明：全身性出血导致的血量减少性休克，在犬狂犬病发病机制和导致PRV感染的犬死亡方面发挥重要作用。无论是在自然或实验感染PRV的犬很少观察到总的神经系统的病变。自然感染PRV犬的中枢神经系统的组织学（CNSS）发现的仅局限于脑干。这与以往的报道PRV犬等非自然宿主，如猫和狐狸一致。然而，实验条件下感染PRV的犬没有中枢神经系统病变。相反，观察到了显著的非化脓性神经炎及在所有实验条件下均观察到PRV抗原。类似的调查结果已在小鼠外周神经系统神经节中有报道（PNSs）。不幸的是，本研究未对自然PRV感染犬进行外周神经节检测。一些研究人员认为，观察到的唾液分泌增多可能由于三叉神经炎。而瘙痒是由于三叉神经节和背根神经节的感染引起的。野生型病毒感染的动物显示一个戏剧性的周围神经病变，不会死于脑部感染。在前人的研究基础上，可能是PRV病毒诱导PNS病理变化，损害交感神经功能，导致受感染犬的器官功能障碍甚至死亡。在自然条件和实验感染PRV病毒的犬发现心脏病变是突出结果，与其他报道一致。值得注意的是，在临床上经常观察到PRV感染犬出现渐进性呼吸急促，在尸检时往往表现在心脏病变上。因此，我们认为，呼吸急促的原因可能是由于心脏损伤。我们测量了犬血清肌钙蛋白ⅠcTn-I水平，因为cTn-I是心肌损伤的特异性指标。实验PRV感染犬活着时五条中有三条出现心肌损伤时cTn-I水平升高。cTn-I水平的统计分析表明，在PRV感染的犬中cTn-I明显升高（P＜0.05??）比无心肌损伤犬。这些研究结果表明PRV感染犬心肌损伤是一种非常重要的特异性病变，cTn-I指标对疑似PRV感染犬是很好的参考指标。在自然和实验条件PRV感染的犬观察到瓣膜血栓。极有可能的是，在这项研究中观察到血栓是继发于瓣膜损伤和全身出血，因为心脏血栓通常是由内皮损伤引发。很有可能的是，星状神经节和内皮破坏引起的心肌神经炎导致过度的交感神经刺激，引发心律失常，甚至导致猝死。值得注意的是，肺巨噬细胞已被确定为猪伪狂犬病病毒的靶细胞，而病毒复制诱导吞噬细胞大量涌入。感染猪的肺组织中也有坏死的发生。造成大量组织破坏，导致呼吸道症状，如打喷嚏、咳嗽、鼻分泌物和呼吸困难等。在目前的研究中，在自然野毒感染犬染晚期经常出现迅速恶化的呼吸急促、呼吸困难。两实验感染犬均观察到突出的心脏病变。然而，在肺组织中也没有检测病毒抗原和坏死。对感染PRV小鼠的在脊髓膈运动神经元和延髓呼吸中枢没有发现PRV。因此，非自然宿主病毒引起急性死亡可能是由于神经型呼吸衰竭。我们认为，过度的交感神经心脏刺激，和神经炎，及心脏损伤，可能导致心腔和肺水肿和充血。这可能是由心脏衰竭引起的，从而产生心脏性哮喘。因此，它极有可能是，犬的呼吸道症状既不是由于原发性肺损伤也不是由于呼吸中枢感染引起的，而是由心源性病变导致。这也可以解释为什么PRV感染犬渐进性哮喘呼吸困难临床上胸部X线片无明显肺部病变。在所有的自然和实验感染的犬观察到不完全收缩的脾。

 

在自然和实验感染的犬的胸腺和淋巴结中的淋巴细胞减少PRV感染狐狸已观察到淋巴器官的增生，虽然在本研究中未观察到。淋巴系统增生的缺乏可能会引起广泛的损害。早期研究者认为猪的感染性淋巴细胞为PRV病毒的传播提供了另一种途径。然而，我们没有检测到病毒抗原在这些犬的淋巴器官或组织。在自然PRV感染犬中也发现了肝坏死，但实验条件下PRV感染犬没有出现。这可以归因于这样一个事实：犬，异物主要通过肝脏枯否细胞去除，从而产生过量的细胞因子。

 

因此，自然的PRV感染犬更易发生肝损伤，可能是因为他们已经在他们的生活中接触到各种病原体。自然PRV感染的犬也往往显示急性肾炎，而实验感染犬不出现。这种差异的原因还不清楚。看来，肾炎是归属于免疫复合物的沉积，由于免疫复合物肾炎常与过滤选择性的丢失有关，因此小管内蛋白质引起管腔扩张。另一个可能的解释是，PRV同抗原交叉反应。在这项研究中，肾上腺出血局限于皮质，特别是网状带，促肾上腺皮质激素刺激导致该地区出血。这种现象也被报道在水貂研究中。免疫组织化学染色的方法检测病毒抗原也显示许多交感节后神经元（星状，腹腔和肠系膜后神经节）感染。然而，没有在肾上腺检测到病毒抗原，即使肾上腺髓质实质细胞是修饰的交感神经元。为什么肾上腺皮质区是敏感易出血区？目前还不太清楚。犬被认为是接触病毒或猪的生肉或内脏，或通过接触感染的猪或猪的尸体。然而，在目前的研究中，13的自然野毒感染犬没有直接接触猪或猪的尸体的历史。虽然在猪间，通过空气会传播病毒。它没有被报道在犬。

 

因此，犬可能是接触受污染的垃圾或食物，通过一个受伤的消化道感染PRV。咀嚼硬物导致的受伤，能增加犬感染PRV的易感性。

 

结论:  根据我们的研究结果，我们得出这样的结论：病毒引起全身出血，PNS病变和/或心脏损伤单独或共同导致PRV感染的犬死亡。心源性病变导致观察到PRV感染犬的呼吸道症状。