摘要：本研究的目的是解决穿透性角膜移植术后早衰对角膜内皮细胞的影响的问题。因为供体角膜内皮细胞的质量对角膜移植的成功很重要.

 

 

介绍：人角膜内皮细胞（HCECs）形成一个再生潜力有限的单层膜，这些细胞通过离子泵机理保持基质脱水。在过去的50年中，穿透性角膜移植术（PKP）是角膜内皮特异性功能障碍疾病的标准治疗。而不是更换整个角膜，角膜内皮移植术（EK）与后基质移植盘 或内皮取代患者的内皮细胞。这个相对较新的程序已经彻底改变了血管内皮细胞的疾病的治疗。供者角膜内皮细胞的质量对角膜移植手术的成功具有重要的作用。供者内皮细胞的状态可能是移植后透明度和长期生存的必要条件。随着时间的推移内皮细胞损失，角膜移植术后角膜混浊，移植后五年变成实质。目前很少有了解加速术后血管内皮细胞的损失的机制。DNA断裂和氧化损伤引起的环境恶化，遗传缺陷或内源性过程属于某些类型的DNA损伤。活性氧引起的氧化应激的关键作用之一是诱导细胞衰老。大量研究显示：过早衰老与器官移植有关，如肾移植。细胞衰老是一种不可逆的生长停滞状态。它可由多种致癌或紧张刺激包括端粒缩短，INK4a/ARF位点的表观遗传学阻遏触发。HCECs临床结果研究表明，DNA氧化损伤和氧化应激影响HCECs增殖能力。也观察到，体外角膜内皮细胞的衰老，年龄相关的相对增殖能力和衰老特征不是由于衰老的端粒缩短导致的。研究表明，蛋白激酶活性是氧化还原敏感的因为在这些关键蛋白的半胱氨酸残基可以通过氧化剂进行翻译后修饰。多条信号转导通路同细胞衰老和细胞死亡相关，包括p38 MAPK通路。此外，细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）是应激诱导的细胞衰老机制的一个关键因素。据报道，应激激活ASK1加速糖尿病患者内皮细胞衰老。该ask1-p38 MAPK通路的抑制作用对预防血管老化和治疗神经退行性疾病和心脏疾病用可能是有用的。而ask1-p38 MAPK信号通路相关的细胞早衰在穿透性角膜移植术后角膜内皮细胞的发病机制还不是很清楚。

 

方法：动物与正常风险的原位角膜移植：6-8周龄BALB/c（H-2d）小鼠和C57BL／6小鼠（H-2b），体重18～20 g，从中国科学院动物研究所获得。小鼠随机分为两组，同系和同种异体组，每组20只。角膜移植的方法如前所述。雄性C57BL／6小鼠作为供体，同龄的雄性BALB/c小鼠作为受体。同系移植雄性Balb/c小鼠作为供、受体程序的结果进行比较。局部或全身均没有使用免疫抑制药物。每只动物只有右眼用于角膜移植，左眼不受干扰。角膜移植术后4.5个月采集移植片，从移植片分离角膜内皮细胞。PCR分析，将样品分为6组（SP1、SP2、SP3、AP1、AP2和AP3）每组包括三个角膜内皮细胞样本。Western blot分析，样品分成6组（SW1、SW2、SW3，AW1，AW2和aw3）每组包括两个角膜内皮细胞样本。

 

小鼠角膜移植的临床评价，用台盼蓝和茜素红S角膜内皮细胞双重染色，免疫组化：小鼠角膜移植后每周进行一次裂隙灯显微镜检查连续两周。移植物的不透明度用1-5来区分。接受两个连续的分数为3，角膜移植被认为是失败的。所有的检查都是由两个双盲的观察者进行的。台盼蓝和茜素红S对角膜内皮细胞进行双染色。角膜样品被固定在冷甲醇中，样品使用elivision?试剂盒进行染色。根据说明书，使用荧光E800显微镜观察。

 

基于实时PCR的阵列分析：采用Nucleospin RNA II系统纯化小鼠角膜内皮细胞总RNA。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA第一链（1μg/μL）。实时PCR阵列和数据分析使用RT2探查?PCR检测小鼠氧化应激和抗氧化防御PCR阵列。

 

患者组织样品采集：从角膜移植失败患者上收集15个新鲜的功能失调角膜扣（直径7.25至8毫米）。进一步的样品制备后，选择了五个样品进行分析。由山东（青岛）的眼科银行国际联合会提供的器官捐赠者的性别匹配的正常人角膜样本作为对照组。3个样品用于SA-β-Gal染色（21，25，19岁），四个样品用于基因表达谱（21岁，27，30岁和31岁）。五个样品（3个22岁和2个25岁）用于HECEs培养。穿透性角膜移植术圆钻取供体角膜后剩余部分全周内皮组织被立即收集用于实验。所有样品均在4°C的角膜存储介质中保存，直到实验前。

 

RNA提取与基因表达谱研究：总RNA使用RNA II系统纯化，根据试剂盒说明，使用MMLV逆转录酶合成第一链cDNA合成。基因表达谱的研究，包括标记、杂交、扫描，正常化，和数据分析。

 

人角膜内皮细胞（HCECs）培养和治疗：正常角膜供体五个角膜缘样品被用于进行HCECs培养。后弹力膜与内皮完整仔细地剥离，培养前然后用optimem-i添加10% FBS过夜稳定细胞。离心后，内皮层组织0.02%的EDTA溶液孵育37°C 1小时细胞悬浮于含8%胎牛血清的培养基optimem-i，5ng/ml 表皮生长因子 (EGF) 20ng/ml的，神经生长因子（NGF），100g/ml的垂体提取物, 20g/ml的抗坏血酸，200 mg/L的氯化钙，0.08%的硫酸软骨素，50g/ml的庆大霉素，抗菌/抗真菌溶液稀释1 / 100。37°C, 5%二氧化碳孵育箱培养。在37°C, 培养的上皮细胞在不同的过氧化氢浓度（0至100μM）经过不同的时间（0min、1h、2h和6h）处理。无过氧化氢处理的细胞作为对照组。此外，HCECs也用SB203580（10μM）和无SB203580处理细胞作对照组。

 

衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性染色：用4%的甲醛对人的角膜进行整体固定（与内皮细胞侧）。在37°C该组织使用的衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒过夜孵育。染色可视化和使用配备数码相机的显微镜拍照。

 

免疫荧光染色：为了免疫荧光染色，小鼠角膜组织与内皮侧被放置在4%PFA溶液进行固定。然后，4°C样品与原抗体孵育过夜（p-ask1和p-p38）。用PBS洗涤后，样品与FITC标记的二抗共孵育1 h（1:100）。细胞用DAPI复染，显微镜下观察。

 

 

结果：穿透性角膜移植术后角膜植片内皮细胞早衰：三次使用正常风险的原位小鼠角膜移植模型（共60只），评估了内皮细胞早衰。三次收集了8，11，和10角膜移植。每一次，两组的四个角膜移植被用于染色的检测。一角膜移植片分为三块，一块是用台盼蓝和茜素红S对角膜内皮细胞染色。其他被用于SA -β- Gal染色和8-OHdG免疫组化分析。小鼠角膜移植与角膜内皮细胞的临床评价结果见图。内皮细胞最初的六角形结构保持在同系组。异体组的角膜移植的内皮细胞的边界是不透明的，多出现在同种异体组。SA -β-Gal阳性细胞出现在同种异体角膜移植组的内皮细胞，而同系移植组角膜植片内皮细胞均未观察到SA -β-Gal阳性细胞。相比角膜内皮细胞的胞浆，在核内观察到较高的8-OHdG表达。同种异体角膜移植核组8-OHdG表达明显高于同系组。

 

Western blot分析比较角膜植片内皮细胞p16INK4a的表达，p21WAF1/CIP1和p53蛋白。与同系移植相比，同种异体移植的角膜内皮细胞p16INK4a，p21Waf1/Cip1和p53蛋白的表达显著上调。

 

小鼠氧化应激和抗氧化rt2-pcr阵列被用来研究穿透性角膜移植术后角膜移植的内皮细胞氧化抗氧化失衡。如有表达两倍以上的变化，P?<?0.05，被认为具有统计学意义。检测的84个基因，27个转录（32%）下调，其中，17个表达两倍以上的水平下调和11（13%）个较高的表达，如三维轮廓和散点图显示。较低水平表达的基因中，有23个抗氧化基因有统计意义。编码谷胱甘肽过氧化物酶7（GPx7）、乳过氧化物酶（LPO）和NADPH氧化酶1（Nox1）基因表达水平较低分别为4.48-fold、4.32和4.14-fold。分别是同种异体角膜内皮细胞与自体角膜内皮细胞比较的结果。在同种异体角膜标本，Western blot检测GPx7，LPO和Nox1表达分别为2.22-fold， 2.38-fold和9.10-fold水平较低。同种异体角膜标本内皮，GPX3和Gat分别比同源角膜的内皮细胞样品高1.17-fold和1.58-fold水平。结果表明ROS积累和ASK1/p38小鼠模型信号通路的活化。升高的活性氧水平可能是氧化-抗氧化失衡的结果。正常人角膜内皮细胞相比，角膜移植术后角膜内皮细胞观察到更多的SA -β-Gal阳性细胞。这些结果与在小鼠模型中的结果是一致的。

 

通过ask1-p38 MAPK途径HCECs氧化应激，ROS水平升高， CDK抑制剂上调和ROS介导p16 INK4a上调：鉴于角膜移植的内皮细胞参与了氧化-抗氧化不平衡，我们开发了体外实验模型，使用过氧化氢处理模拟氧化应激状态。人角膜内皮细胞原代培养与功能相关指标如Na+ K+ ATP酶和ZO-1以及Prdx6。对细胞内活性氧和线粒体活性氧的积累进行了比较。100μM过氧化氢处理HCECs M60分钟后观察ROS的产生。数据表明，细胞内ROS水平在过氧化氢处理过的HCECs比未经处理的细胞高得多。SA -β-Gal的阳性率也在和100μM 过氧化氢处理HCECs60分钟后观察到。要确定是否过氧化氢处理后HCECs线粒体ROS的产生增强，采用MitoSOX红，MitoTracker绿色调频的定位术。由Mito Tracker Green的定位显示，与对照组HCECs比较，过氧化氢处理的细胞中线粒体呈红色荧光，表明增加线粒体产生活性氧。

 

细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）抑制剂被认为在细胞周期阻滞和早衰方面发挥关键作用。因此我们研究了在HCECs活性氧对CDK的抑制水平，包括p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1。2小时100μM 过氧化氢处理后，在HCECsp16INK4a、p21Cip1和p27kip1 mRNA表达水平上调。通过Western blot分析，我们也检测p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1蛋白的表达水平。100μM 过氧化氢处理HCECs后，p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1蛋白表达水平升高，而这种上调坚持过氧化氢处理后2至6小时。

 

是否过氧化氢诱导的HCECs衰老与ask1-p38 MAPK通路的活性有关，蛋白质印迹分析测定ASK1的蛋白质水平或磷酸化ASK1。体外对过氧化氢处理和未处理的HCECs进行p38 MAPK的活化比较。在过氧化氢处理后HCECs的ASK1和p38 MAPK的磷酸化水平显著增加。对体外培养的上皮细胞，使用siRNA特异沉默ASK1和SB203580，广泛使用的p38抑制剂，探讨过氧化氢诱导的内皮细胞衰老的分子机制。通过Western blot分析，我们发现，转染ASK1 siRNA后ASK1表达下调，在HCECASK1 siRNA s也降低MAPK活性。

 

结论：我们的观察表明ROS标志物（氧化防御基因），和衰老标志物（与衰老有关的SA-β-Gal和蛋白质如p16INK4a / P21WAF1/CIP1 / p53）表达水平升高。还发现，在这种情况下，p38MAPK和ASK1通路被激活的证据。这些观测数据将与活性氧通路>p38/ASK1>衰老一致。反过来说明在角膜同系移植过程中发生SIPS过程。我们的研究结果将为角膜移植术后功能障碍的分子发病机制提供新的见解。

http://link.springer.com/article/10.1186/s12886-016-0192-6