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生物谷讯/--基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

最近，科学家们利用CRISPR-Cas9首次让人细胞变身为记忆存储系统，有望靶向清除多种疱疹病毒感染和用于治疗血液疾病，直接改变细胞身份，高效和特异性地实现靶DNA单碱基突变等等。更为重要的是，我国科学家将进行世界首个人类CRISPR基因编辑临床试验。

接下来，小编列举最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展，详情如下所示。

1、Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9让人细胞变身为记忆存储系统
Science, doi:doi:10.1126/science.aag0511

在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院（MIT）的研究人员设计出一种方法在人细胞的DNA中记录复杂的历史事件，从而允许他们通过对这种DNA进行测序从中找回过去事件的“记忆”。相关研究结果于2016年8月18日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells”。论文通信作者为MIT电学工程与计算机科学副教授和生物工程副教授Timothy Lu。论文第一作者为Samuel Perli博士和研究生Cheryl Cui。

在当前的这项研究中，由MIT开发出的这种新方法是基于基因组编辑系统CRISPR-Cas9实现的，其中这种系统是由一种DNA切割酶Cas9和一种引导这种酶结合到基因组特定位点上并指导它在这个位点进行切割的短链RNA---也被称作向导RNA（gRNA）---组成的。

CRISPR-Cas9被广泛地用于基因编辑，但是Lu团队决定对它进行改编用于记忆储存。在最初进化出CRISPR-Cas9的细菌中，这种基因组编辑系统记录过去的病毒感染，这样细菌细胞就能够识别和抵抗再次入侵的病毒。

当利用CRISPR-Cas9对基因进行编辑时，研究人员构建出能够匹配宿主基因组中靶序列的gRNA。为了进行记忆编码，他们采取一种不同的方法：他们设计出识别编码这种gRNA的DNA序列的gRNA，从而产生他们称之为“自我靶向的gRNA（self-targeting guide RNA）”。

在这种自我靶向的gRNA的引导下，Cas9切割编码这种gRNA的DNA序列，产生一种永久性记录事件发生的突变。这种DNA序列一旦发生突变就会产生新的gRNA来引导Cas9靶向这种新近发生突变的DNA序列，而且只要Cas9是有活性的或者这种自我靶向的RNA仍然表达，就允许突变进一步发生和积累。

通过细胞内的感应器检测特定生物事件发生来调节Cas9或自我靶向的gRNA的活性，这种系统就能够允许累进性突变作为这些生物事件的函数积累下来，因而提供基因组编码记忆。

2、Cell：利用CRISPR辅助的纳米显微技术揭示端粒酶探查端粒机制
Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.07.033

在一项新的研究中，美国科罗拉多大学博尔德分校生物前沿研究所主任、特聘教授和诺贝尔奖得主Thomas Cech博士利用CRISPR基因编辑技术、活细胞和单分子显微镜，首次实时地观察端粒酶和端粒之间的这种至关重要的相互作用。相关研究结果于2016年8月11日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Live Cell Imaging Reveals the Dynamics of Telomerase Recruitment to Telomeres”。

Cech与论文共同作者Jens Schmidt和Arthur Zaug观察到端粒酶在整个细胞核中扩散，和进行碰撞。端粒酶和端粒在细胞核中并不常见，但有时凑巧会看到前者撞击后者。但是端粒酶附着到端粒的中间位置上时是不会带来任何好处的。为了保护染色体，端粒酶必需附着到它的最末端。因此如果端粒酶撞击到端粒的中间位置，那么它很快脱落下来，再次尝试撞击。Cech和同事们将这成为“探查（probing）”。仅当这种探查导致端粒酶直接撞击到端粒的末端时，它才附着到端粒上，并且逗留在那里。

Cech团队能够利用CRISPR DNA编辑技术将一种基因插入到制造端粒酶的基因上。这种插入的基因编码一种附着到端粒酶上的荧光蛋白。他们随后利用一些人称作为纳米显微镜的显微技术观察这种荧光蛋白。

Cech指出这种CRISPR辅助的纳米显微镜（CRISPR-aided nanoscopy）技术将可能被端粒研究领域之外的科学家们使用。他也希望这一发现将有助于筛选抗端粒酶药物。

3、Nat Commun：利用非同源性DNA片段将CRISPR-Cas9编辑效率提高高达5倍
Nature Communications, doi:10.1038/ncomms12463

CRISPR-Cas9是一种用于在人细胞系中进行基因敲除来发现它们的基因所发挥何种功能的流行技术，但是让基因失去功能的效率存在非常大的差异。

如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校的研究人员在大多数类型的人细胞中，发现一种方法让CRISPR-Cas9切割靶基因和让它们失去功能的效率提高高达5倍，从而能够更加容易构建和研究基因敲除细胞系以及潜在地作为一种人类疗法让一个发生突变的基因失去功能。相关研究结果于2016年8月17日在线发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes”。

尽管CRISPR-Cas9能够加快制造基因敲除细胞系的过程，但是人们有时必需制造和筛选许多这种基因编辑器的变异体以便发现哪一种发挥得更好。在这项研究中，研究人员发现只需经过简单调整一下就能够更加有效率地开展这个过程。

关键就是与CRISPR-Cas9分子一起被导入人细胞中的短片段DNA不与人基因组中的任何DNA序列相匹配。这些短片段DNA被称作寡核苷酸，似乎干扰人细胞中的DNA修复机制，从而将比较普通的CRISPR-Cas9的基因编辑效率提高2.5到5倍。

论文通信作者、加州大学伯克利分校创新基因组计划科技总监、分子与细胞生物学兼任助理教授Jacob Corn说，“它表明如果你做了非常简单的事情---只是将廉价的与人基因组不存在任何同源性的人工合成寡核苷酸导入到细胞中，那么基因编辑效率提高多达5倍。”这种技术提高所有CRISPR-Cas9的编辑效率，即便是初始时完全不会起作用的那些CRISPR-Cas9。

4、Nat Med：CRISPR基因编辑技术或有望治疗血液疾病
Nature Medicine, doi:10.1038/nm.4170

刊登于国际著名杂志Nature Medicine上的一项研究报告中，来自圣犹大儿童研究医院的研究人员通过研究利用CRISPR基因编辑技术就可以帮助治疗镰刀形细胞病以及β地中海贫血症，该研究为后期通过基因组编辑技术来开发治疗常见血液障碍的新型疗法提供了一定帮助。

研究者Mitchell J. Weiss说道，我们所利用的基因编辑方法对于治疗遗传性胎儿血红蛋白持续存在症具有一定益处，我们很早就知道，机体中胎儿血红蛋白水平持续升高，且携带遗传突变的个体往往对镰刀形细胞病及β地中海贫血症的症状有一定的耐受性，严重贫血的遗传形式在地球上很多区域都非常常见，这项研究中研究者就发现了一种方法，可以利用CRISPR基因编辑技术来对患者产生类似的有益效应。

此前研究者们知道，抑制或逆转血红蛋白亚单位的γ-β开关就可以提高成年人机体中胎儿血红蛋白的水平，同时还会明显改善β地中海贫血症或镰刀形细胞病患者的虚弱症状，研究者Weiss补充道，这项研究中我们发现了一种基因组编辑介导疗法的潜在DNA靶点，并且为治疗β地中海贫血症及镰刀形细胞病提供了一种新方法。如今我们利用CRISPR基因编辑技术就可以靶向作用DNA，移除刺激γ-β开关的DNA片段，同时促进成体红细胞中胎儿血红蛋白水平的持续性增长。

本文研究就揭示了除现有许多创新性策略的另外一种方法，同时研究者还比较了该实验系统所产生的胎儿血红蛋白的水平。利用基因组编辑技术来恢复遗传性胎儿血红蛋白持续存在症或许是一种非常有吸引力的选择；研究者强调说，目前利用这种新型基因编辑方法进入临床试验还维持过早，后期我们希望能够继续深入研究来改善基因编辑过程，并且再进行其它实验来将潜在有害的脱靶突变的可能性降到最低，此外对不同方法进行对比来确定哪种方法最安全且最有效也是非常关键的，有待于我们后期进一步研究分析。

5、Cell Stem Cell：利用改进的CRISPR/Cas9技术直接改变细胞身份
Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2016.07.001

在一项新的研究中，来自美国杜克大学的研究人员开发出一种不再需要导入额外基因拷贝的策略。相反，他们利用一种经过基因修饰的CRISPR/Cas9基因编程技术直接激活已经存在于细胞基因组中的自然拷贝。相关研究结果于2016年8月11日在线发表在Cell Stem Cell期刊上，论文标题为“Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells”。

在这项新的研究中，Black、Gersbach和同事们利用经过基因修饰的CRISPR/Cas9技术准确地激活三种基因Brn2、Ascl1和Myt1l来自然地产生这些控制神经元基因网络的主转录因子，而不是导入携带这些额外基因拷贝的病毒。

研究人员先将细菌防御系统CRISPR/Cas9进行基因修饰让它与一种基因激活物偶联在一起，这样仍然能够鉴定出特异性的DNA片段，但是不会切割靶片段，而是让它们保持完整，同时利用基因激活物将靶片段激活。

在实验室中，将这种经过基因修饰的CRISPR/Cas9系统注射到小鼠胚胎成纤维细胞中。检测结果表明一旦被这种系统激活，这三种神经元主转录因子基因就强力地激活神经元基因。这导致这些成纤维细胞传导电信号---神经元的一种典型特征。而且即便将与CRISPR/Cas9偶联的基因激活物取走后，这些细胞仍然保持它们的神经元性质。

这些实验证实利用这种经过基因修饰的CRISPR/Cas9技术产生的神经元在靶基因上的表观遗传程序与在小鼠大脑组织中自然发现的神经元标志相匹配。

根据Black的说法，接下来的行动方案就是将这种方法拓展到人类细胞中，提高这种技术的效率，并且试图清除其他的表观遗传障碍，这样它可能能够用来构建特定疾病模型。

6、Science：利用改进的CRISPR/Cas9系统高效和特异性地实现单碱基突变
Science, doi:10.1126/science.aaf8729

在一项新的研究中，利用一种引入DNA单个核苷酸变化的脱氨酶，来自日本神户大学的研究人员构建出一种改进的CRISPR/Cas9工具，从而避免产生有害的双链断裂，使得利用CRISPR/Cas9技术引入的附带突变最小化，而且也不需要加入DNA模板。相关研究结果于2016年8月4日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems”。

利用CRISPR/Cas9系统，人们通过将Cas9导入到细胞中对一种DNA序列进行编辑而产生双链断裂，同时也将一种DNA模板导入到这种细胞中，这样该细胞利用这种DNA模板修复这种断裂。这种编辑过程依赖细胞的同源重组机制，然而其他的修复机制如NHEJ也来竞争执行这种修复任务，因而经常导致不想要的和不准确的序列插入和删除。

为了构建一种更加准确的编辑工具，神户大学科学家Akihiko Kondo和他的同事们将一种没有核酸酶活性的不能够切割双链DNA的Cas9版本或一种产生单链切口的切口酶Cas9版本与一种来自七鳃鳗（sea lamprey）免疫系统的激活诱导性胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起。在正常情形下，这种AID酶在免疫球蛋白和抗体基因中产生突变从而让免疫系统具有多样性。AID作用在单链DNA上，将胞嘧啶（C）替换为尿嘧啶（U），随后在一轮DNA复制中，这种尿嘧啶（U）被转化为胸腺嘧啶（T）。

通过测试这种新的杂合复合物是否能够在出芽酵母---缺乏一种内源性的类似AID的系统---中修饰一种选择性的标志物，Kondo团队发现当在向导RNA（gRNA）的引导下，这种蛋白复合物靶向作用于CAN1基因，而且相对于非靶向的选择性标志物，CAN1基因发生突变的频率增加了1000倍。利用全基因组测序，研究人员发现很少的脱靶突变，只比背景突变率略有增加。论文第一作者、Kondo实验室博士后研究员Keiji Nishida说，“[在AID存在下]，这种脱靶突变率是可以接受的，相比于自然的背景突变率增加了不到10倍。”

研究人员也证实将两种不同的gRNA与Cas9-AID复合物一起表达能够同时对两种基因进行修饰。

相比于没有核酸酶活性的Cas9-AID复合物，切口酶Cas9-AID复合物能够在核苷酸替换位点的相反链上产生切口，基因编辑效率略高一些。Nishida解释道，这是因为核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）能够修复AID产生的核苷酸替换，“如果在互补链上产生一个切口，那么就不再有参照链来校正替换突变”，从而使得想要的核苷酸替换过程更有效率地进行。

为了进一步修饰，研究人员将尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase）抑制剂---与这种Cas9-AID复合物连接在一起，从而增加这种复合物产生C-T替换的效率，同时使得在哺乳动物细胞系中发生的不想要的缺失突变最小化。

这种基因编辑复合物也能够在哺乳动物细胞系中表现良好，导致相对少的脱靶突变。在酵母细胞中，相对于表达标准的CRISPR/Cas9系统，表达上述两种改进的DNA编辑复合物中的任何一种都能够导致它们更好的生长，这提示着这种新的编辑工具也是毒性更小的。

7、重磅！中国科学家将进行世界首个人类CRISPR基因编辑临床试验

如今，中国科学家即将利用CRISPR–Cas9基因编辑技术将修饰后的细胞注入人体进行人类临床试验，这将是世界上首个在人类机体中进行的CRISPR试验。

进行这项研究的是来自四川大学华西医院（West China Hospital）的研究者Lu You（卢铀），他计划下个月在肺癌患者机体中检测利用CRISPR–Cas9修饰后的细胞的性能，这项临床试验已于7月6日获得了医院伦理审查委员会的批准审核。研究者卢铀，毕业于华西医科大学，长期从事肺癌和食管癌等胸部肿瘤放化疗和分子靶向治疗的临床与基础研究，肿瘤综合治疗及抗肿瘤新药临床试验研究。

这项在中国进行的人类临床试验将会招募转移性的非小细胞肺癌患者和化疗、放疗及其它疗法相继失败的肺癌患者，研究者Lu表示，目前针对癌症的疗法选择非常有限，而基于CRISPR的技术或将为多种疾病的患者带来光明，尤其是那些每天需要治疗的癌症患者。

研究者Lu的研究团队将从招募的患者机体提取免疫细胞-T细胞，随后利用CRISPR–Cas9基因编辑技术敲除细胞中的特殊基因，该基因所编码的蛋白PD-1可以扮演细胞检查点的角色，其可以对细胞发起的特殊免疫反应进行检查，从而抑制健康细胞被攻击。CRISPR–Cas9技术可以同分子向导配对来识别出携带特殊酶类的染色体上的特殊遗传序列。

随后研究者在实验室中扩增被基因编辑的细胞，并将这些修饰后的细胞重新注入到患者的血液中，这些工程化的细胞就可以在患者机体中进行循环并且“游入”癌症组织中；即将在美国进行的临床试验也利用了类似的方法来敲除编码PD-1的基因，同时研究者还计划敲除第二个基因，并在细胞重新注入患者体内之前插入第三个基因。

最后研究者Lu说道，我希望我们是第一个进行这项临床试验的人，更重要的是，我们希望可以通过这项临床试验获得足够多的积极性证据。

8、重磅！科学家质疑巨病毒存在类似CRISPR/Cas的系统
Virologica Sinica, doi:10.1007/s12250-016-3801-x

在很多细菌中发现的CRISPR/Cas免疫防御系统，因其能够简单地而又优雅地编辑宿主基因组，而成为时下最火热的生物技术，在近期产生一大批发现。在今年3月，来自法国艾克斯-马赛大学的Didier Raoult和同事们发表一篇论文，指出一种被称作mimivirus的巨病毒（giant virus）拥有一种类似于CRISPR系统的被称作mimivirus噬病毒体抵抗元件（mimivirus virophage resistance element, MIMIVIRE）的噬病毒体抵抗机制（Nature, 10 March 2016, doi:10.1038/nature17146）。而在上个月发表在Virologica Sinica期刊上的一篇论文中，来自法国国家科学研究院（CNRS）的Jean-Michel Claverie和Chantal Abergel对这种观点提出挑战。

Claverie和Abergel在他们的论文中写道，“MIMIVIRE并不类似于CRISPR-Cas系统，并不能够作为一种核酸识别系统发挥作用，也不可能拥有一种真正的适应性免疫系统所拥有的所有性质。”

Claverie和Abergel继续质疑这种噬病毒体抵抗机制到底是不是基于核酸的。他们提出蛋白可能干扰这种抵抗噬病毒体的mimivirus中的噬病毒体复制。

但是，Claverie和Abergel声称这种mimivirus防御机制一点都不像CRISPR系统。首先，mimivirus基因组和噬病毒体复制发生在相同的地方，“这就不可能获得基于核酸的免疫系统”。再者，CRISPR代表着规律间隔性成簇短回文重复序列，而MIMIVIRE序列“并不是规律间隔性的，而且在两侧也不存在可识别的重复序列”。最后，与MIMIVIRE序列相对应的Zamilon序列缺乏被称作前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的序列，其中细菌宿主通常利用这一序列区分病原体DNA和它们自己的DNA。

9、Angew Chem：利用CRISPR/Cas9让沉默基因不再沉默
Angewandte Chemie, doi:10.1002/anie.201601708

CRIPSR/Cas9是细菌天然地用来抵抗病毒感染的一种免疫系统。它允许科学家们在基因组靶位点上精确地导入、移除或替换特异性的DNA片段。迄今为止，CRISPR/Cas9是最为高效的、廉价的和最容易操作的基因编辑工具。然而，科学家们在此之前还不能够高效地利用它激活细胞中的基因。

在一项新的研究中，来自日本北海道大学遗传医学研究所的Toru Kondo团队利用CRISPR/Cas9系统开发出一种强大的方法做到这一点。相关研究结果发表在2016年5月23日那期Angewandte Chemie期刊上，论文标题为“A Powerful CRISPR/Cas9-Based Method for Targeted Transcriptional Activation”。

细胞中的基因拥有它们自己的开关：启动子。当基因的启动子发生甲基化时，该基因就被关闭，或者被沉默。

在这项新的研究中，研究人员想要高效地激活沉默基因（即因启动子发生甲基化被关闭的基因，也就是不发生转录的基因）。他们将一种被称作微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining, MMEJ）的DNA修复机制与CRISPR/Cas9组合使用。他们利用CRISPR/Cas9切掉发生甲基化的启动子，然后利用MMEJ插入一个未发生甲基化的启动子，也就是利用基因的开启开关替换它的关闭开关。

研究人员在神经细胞基因OLIG2和胚胎干细胞基因NANOG上使用了这种工具以便测试它在体外培养的细胞中的效率。在5天内，他们发现证据证实这些基因强效地表达。在当体外培养的人胚胎干细胞中利用这种方法激活OLIG2基因时，它们在7天内高效地分化为神经元。

研究人员也发现他们的基因编辑工具可能能够被用来激活其他的发生沉默的启动子。此外，他们发现这一系统并不会导致细胞中其他的非靶向基因发生不想要的突变。这种工具有巨大的潜力被用来操作基因表达，构建基因电路，或者改变细胞命运。

10、PLoS Pathog：利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多种疱疹病毒感染
PLoS Pathogens, doi:10.1371/journal.ppat.1005701

大多数成年人携带着多种疱疹病毒。在初始的急性感染后，这些病毒在它们的宿主体内建立终生感染，并导致唇疱疹、角膜炎、生殖器疱疹、带状疱疹、传染性单核细胞增多症和其他疾病。一些疱疹病毒还能够导致人们患上癌症。在潜伏性感染阶段，这些病毒长时间地保持潜伏状态，但是保持偶尔重新激活的能力。这种重新激活有可能导致人们患病。一项新的研究提示着利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术攻击疱疹病毒DNA能够抑制病毒复制，而且在一些情形下，能够导致病毒清除。相关研究结果于2016年6月30日发表在PLoS Pathogens期刊上，论文标题为“CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections”。

在这项新的研究中，来自荷兰乌德勒支大学医学中心的Robert Jan Lebbink和同事们认为应当能够靶向作用于被感染的人细胞中的潜伏性疱疹病毒DNA并让它们的DNA发生突变，因而潜在地阻止疱疹病毒相关的疾病。为了测试这一点，他们设计出特异性的向导RNA（gRNA），即与疱疹病毒基因组的关键部分互补的且发挥着分子地址作用的短RNA片段。这些gRNA当与CRISPR/Cas9系统中发挥着分子剪刀作用的Cas9结合在一起时，应当能够诱导在疱疹病毒DNA的特定位点上发生切割，随后诱导它们的DNA发生突变，从而破坏这些病毒。

通过采取这种方法，研究人员研究了三种不同的疱疹病毒成员：导致唇疱疹和疱疹性角膜炎的1型单纯疱疹病毒（HSV-1）；人巨细胞病毒（HCMV），最为常见的病毒性出生缺陷病因（当这种病毒由妈妈传播给胎儿时）；导致传染性单核细胞增多症和多种癌症类型的爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV, 也被称作EB病毒）。

研究人员总结道，“我们观察到将EBV从被潜伏感染的肿瘤细胞中高度有效地和特异性地清除出来，以及破坏HSV-1和HCMV在人细胞中的复制。”他们继续说道，“尽管CRISPR/Cas9并不能够高效地对潜伏性HSV-1进行基因组编辑，但是一旦潜伏性HSV-1重新激活，利用HSV-1特异性的gRNA能够高效地阻止HSV-1复制。”他们希望，他们的结果“可能允许设计出高效的治疗策略靶向潜伏性感染和增殖性感染期间的人疱疹病毒。”