摘要：背景 检查喂食高脂饮食（HFD）雌性2型糖尿病糖尿病视网膜病变的存在。

 

 

背景：糖尿病的患病率在世界范围内日益增多。1型糖尿病大鼠模型已被广泛应用于视觉科学家分析糖尿病性视网膜病变相关的分子机制。这些动物是非常脆弱的，在视网膜血管生成前死亡。在2型糖尿病大鼠中，增殖性视网膜病变尚无报道。

 

方法：糖尿病大鼠模型：购买孕Wistar大鼠，饲养在动物设施内（ 21±1°C，明暗各12h ）,每日仔细观察直到分娩。出生后2天的幼龄大鼠腹腔注射链脲佐菌素（SZT）（45毫克/千克），含154mM NaCl 0.1ml 0.1M溶液的枸橼酸盐缓冲液，PH 4.5。幼龄鼠同母鼠饲养在一起，直到21天。8周后，SZT处理的动物饲喂高脂饮食。表中显示高脂饮食的配方，并储存在-7℃.每月开始的一周测量血糖水平。剪断尾巴收集32μL血液样本的和测试。在饲喂高脂饮食组发现血糖水平高（160-220mg/dl）。两组动物分别12只在在57周安乐死和5只在110周被安乐死。

 

对照大鼠：没有注射SZT非糖尿病动物，饲喂2.71%脂肪含量的标准饲料。他们的血糖正常（80-95毫克/分升）。对照组动物12只在62周龄处死和5只在115周龄处死。

 

临床参数：每只动物在第8周和死之前称重。每个月和动物安乐死前用reflotron系统确定血脂异常水平。

 

脂肪酸：高脂饲料配方见表格。高脂饮食中含有25.6%的脂肪（46.4%饱和，47.5%单饱和和6.3%过饱和），而标准的饮食中含有2.71%的脂肪（24.2%饱和，30.2% 45.6%单饱和和过饱和）。

 

临床照片：在动物活着且安乐死前拍摄临床照片。摘取眼球，用30G针头通过角膜注射空气进入前房使角膜血管更明显。

 

组织学检查：用350 mg/kg腹腔注射水合氯醛对大鼠进行麻醉。摘取眼睛并固定在4%多聚甲醛。用过量水合氯醛对大鼠实施安乐死。眼球在一天内固定，然后冷冻浸泡在四种浓度的葡萄糖溶液中5%过夜和7.5%，10%和20%各两小时），树脂封片。获取十微米的切片和苏木精-伊红染色（HE）和过碘酸希夫染色（PAS）镜检。每只动物眼睛至少检查5个部分。

 

免疫组化和免疫荧光分析：眼睛被摘除，4%多聚甲醛固定48小时。然后他们被冷冻浸泡在四种浓度的葡萄糖溶液中（5%过夜和7.5%，10%和20%各两小时），树脂封片。制作切片。免疫组织化学切片，先同生物素标记的羊抗鼠IgG孵化，然后置于一个亲和素-生物素-过氧化物酶复合物试剂盒，最终在3.3-二氨基联苯胺（DAB）/镍溶液。对于免疫荧光，使用二级山羊抗小鼠抗体与荧光素显示轴向切片。使用Eclipse尼康显微镜进行荧光免疫分析。使用抗胶质纤维酸性蛋白初级单克隆抗体分析GFAP表达。使用抗血管内皮生长因子多克隆抗体检查血管内皮生长因子的免疫反应性。抗人vWF被用于检测Von Willebrand因子（vWF）。

 

胰蛋白酶消化技术：角膜切开后，眼球被浸润固定，最少四小时，在4%福尔马林溶液-50mM的钠钾磷酸盐缓冲（pH 7.2）。视网膜进行解剖，然后进一步放置在4%甲醛缓冲溶液数小时。视网膜被切割，流动水冲洗过夜。37°C， 3%胰蛋白酶溶液和0.1 M Tris缓冲液（pH 7.8）孵育一到三小时。完成时，介质变得混浊，组织表现出消化的迹象。内界膜被剥离。轻晃，血管从视网膜组织中脱落。放置在切片上，风干。用PAS和曙红染色。

 

虹膜厚度测量：对所有长期糖尿病动物（LT-DBT）和对照组110周龄动物进行虹膜厚度测量。从瞳孔到虹膜底，分布在300μm之间。每个虹膜使用10个样品。

 

结果：与年龄匹配的对照组大鼠（范围80-120mg/dl，平均100.5 mg/dl，SD 18.8）相比糖尿病大鼠有较高的血糖水平（范围140-416 mg/dl,平均232 mg/dl，SD 81.9）.同对照组动物相比，糖尿病动物模型有高水平的甘油三酯。观察眼前段，临床照片显示5只长期糖尿病动物（LT-DBT）（110周龄）、2只110周龄对照组和出现白内障，而短期糖尿病大鼠和62周龄的对照组大鼠没有出现白内障。LT-DBT老鼠和其他动物组之间的差异有统计学意义（P < 0.05）。在五只长期糖尿病动物中有3只观察到角膜新生血管。新生血管再角膜周边和中心观察到，在每只动物中至少有一个象限的延伸。由于异常血管的存在，所有这糖尿病动物比对照组虹膜明显增厚。在每个虹膜部分至少找到五处新生血管。角膜组织学：在上皮细胞和前基质显示新生血管。在对照组和ST组动物没有发现角膜和虹膜新生血管。观察眼后段，所有LT糖尿病动物发现视网膜内新生血管。四例动物中发现血管扩张或动脉瘤，在对照组和ST组动物都没有发现以上结果。视神经前视网膜血管在两例LT糖尿病动物中发现。视网膜VEGF、vWF免疫反应，分析虹膜和角膜的抗vWF抗体和抗血管内皮生长因子。仅在LT糖尿病动物发现VEGF、vWF表达上调。视网膜显示: 位于纤维层（FL）和在外丛状层（OPL）的血管vWF表达上调。而在OPL发现EGF的上调。在这一层，观察到vWF和VEGF共定位。在虹膜基质血管内发现类似的两种蛋白质共表达（vWF和VEGF）。在角膜基质血管，观察到vWF和VEGF的表达。ST糖尿病组和对照组视网膜、虹膜和角膜中均无vWF和VEGF阳性。发现用胰蛋白酶消化法测定的细胞数，LT糖尿病组显著低于对照组。在FL ，发现GFAP免疫阳性反应，形态上类似于Müller细胞。糖尿病动物比对照组和ST组染色更广泛。

 

讨论：通过对雌性2型糖尿病大鼠喂食高脂饮食建立糖尿病视网膜病变动物模型开展实验研究。糖尿病动物110周后，动物出现视网膜和角膜新生血管以及虹膜红变。据我们所知，这是2型糖尿病大鼠喂食高脂饮食后眼部出现新生血管的第一份报告。值得一提的是，我们在喂高脂饮食的雄性2型糖尿病大鼠，发病90周研究没有发现增殖性视网膜病变的变化。大鼠糖尿病的进展，雌激素的潜在影响是众所周知的。所有年龄组雌性大鼠比雄性对胰岛素的敏感性较低，也更容易快速发展为严重的糖尿病。在科学文献中描述糖尿病大鼠视网膜形态学变化有周细胞的缺失和脱细胞和毛细血管的存在，这些变化导致视网膜缺血。糖尿病大鼠的周细胞比对照组显著较低。可以引起角膜内皮功能障碍的有大泡性角膜病变、角膜水肿、上皮糜烂、炎性细胞因子释放，角膜缘干细胞的缺乏和角膜新生血管。本研究中也在LT 3例糖尿病动物中发现角膜新生血管。

 

结论：动物模型模仿人类疾病，它可以被视为机制与治疗药物的研究的一个平台。为此，已开发的几种眼科病变模型，如氧诱导的视网膜病变模型和采用基因治疗的增殖性糖尿病视网膜病变模型。在我们的模型中，链脲佐菌素注射液，HFD，发病早和糖尿病病程较长，雌性动物被认为是疾病的增长的主要因素。未来的调查将确认这种糖尿病视网膜病变动物模型的实用性。