1．实验方法  6月龄的小型猪，体重约25kg。小型猪常规麻醉，无菌条件下拔除小型猪的上下颌8颗前牙(4颗尖牙，4颗切牙)，立即投入含有双抗的D-Hank平衡盐溶液的无菌包装瓶中，轻轻晃动5～10分钟，将牙根面的血迹冲洗干净，冰浴下立即送往实验室。在超净工作台内，用持针器夹住牙颈部，根面朝上，用20ml无菌注射器抽取无菌生理盐水反复冲洗牙齿根面。锐利的龈下刮治器刮取牙根中1／3的牙周膜，并将组织剪成1mm3左右的小块，每小块间距5mm左右，均匀地接种在25cm²一次性无菌培养瓶的瓶底。倒置培养瓶，向瓶内注入含有200ml／L胎牛血清、100U／ml青霉素和100g／L链霉素的高糖DMEM培养液3ml，放入细胞培养箱(5％CO₂、37℃、100％湿度)孵育。2～4小时待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使液体缓缓覆盖组织小块，静置培养。接种1周内，由于组织块粘贴不牢固，应避免换液和观察，以免组织块受到冲击而飘起。之后每3天更换1次培养液，每次加入3～4ml培养液，密切观察细胞生长情况，发现细胞游出后照相记录。

2．实验结果

(1)小型猪牙周膜细胞培养成功率：在拔除的小型猪4颗切牙和4颗尖牙中，采用组织块培养法，成功培养出4颗切牙的牙周膜细胞，培养成功率50％，其中切牙的培养成功率为100％，尖牙的培养成功率为0。

(2)细胞生长和形态学表现：原代培养第7～14天，倒置显微镜观察到组织块周围有细胞游出。细胞以组织块为中心向四周扩展，也可见到远离组织块游离的个别细胞小团。细胞呈梭形、星形或多角形，突起细长，胞体丰富，胞浆透明，胞核圆形或椭圆形。细胞排列成放射状及漩涡状。原代培养30天左右，细胞相互汇合可达瓶底的80％～90％，进行1：2传代。传代后小型猪牙周膜细胞生长较快，4～6天可再次传代。不同形态的细胞对胰蛋白酶敏感性不同。梭形的成纤维样细胞3～5分钟便可被消化下来，且形态不发生改变。上皮样细胞对胰蛋白酶敏感性差，呈簇状生长，通过细胞传代，牙周膜成纤维细胞可从上皮样细胞中分离出来。

(3)免疫化学鉴定结果：光镜下对第3代小型猪牙周膜细胞进行免疫组织化学染色观察，细胞抗波形丝蛋白染色阳性，阳性颗粒在胞质内分布均匀，胞核清晰无染色。抗角蛋白染色阴性，表明小型猪牙周膜细胞为中胚层组织来源。

(4)细胞生长曲线：小型猪牙周膜细胞生长曲线近似于S形，有明显的滞留期、指数生长期和平台期。接种后24小时内，因受胰蛋白酶消化影响，细胞数量有所减少，以后逐渐增加。从第3天开始细胞增殖加快，进入指数生长期，第8天时细胞数目达峰值，此后细胞长满培养皿，因接触抑制不再分裂、增殖减缓，进入平台期。