专访篇

通过多年的研究，基因工程方法改造动物器官进行移植已经积累了大量的研究案例，特别是基因改造猪在异种移植中的研究已取得重大进展，为临床上提供器官供体越来越近。本期中国实验动物信息网特邀南京医科大学特聘教授、江苏省异种移植重点实验室主任戴一凡教授针对基因改造猪作为器官供体的优势、在解决器官供体短缺方面寻求了哪些研究途径/需攻克的技术难题、CRISPR/Cas9基因编辑技术给基因改造猪的研究带来了哪些突破、异种移植走向临床应用情况等内容为大家讲解。

中国实验动物信息网：请戴教授介绍下目前国内外器官移植需求现状？

戴一凡：器官紧缺是全世界的问题，国外的器官捐献工作做的非常好，一个供体可以给5到6位病人使用，包括肾脏、心脏、肺、肝、胰、还有角膜，但是国外也仍然还有很大的缺口，比如，2015年美国等待器官移植的有13万病患者，最后能拿到的器官也只有3万多，欧洲的数据也差不多。目前中国比国外至少缺10倍以上的器官，器官短缺问题更加严重，在2015年1月1日，中国全面停止使用死囚器官作为供体来源，另外国内现在打击器官买卖非常严厉，医院对非亲属间器官移植需做一些DNA鉴定，证明确实是亲属才可以做移植，这些措施的控制也造成了很多人得不到器官。现在虽然自愿捐献的人数在逐渐增加，由于需求缺口过大，国内器官供体来源仍旧非常紧张。所以如果在人身上拿不到器官，那我们过去二十几年一直想办法把猪作为器官的供体。

中国实验动物信息网：科学家们在解决器官供体短缺方面寻求了哪些研究途径？

戴一凡：在器官短缺的情况下，科学家们试图了多种途径来解决器官供体短缺的问题，目前最理想的技术路径有两种：一是通过基因工程方法改造动物器官进行异种移植，即从动物身上获取健康的器官、组织或细胞，将其移植到患者体内发挥功能；二是在动物体内培育人体器官（即人源化），人源化方法相当于人自己的器官，排异反应更小，更符合人的生理功能，但是人源化所涉及的伦理问题更严。现在国内外有些实验室已在开展相关研究，包括我们实验室也在做，希望能够在动物体内利用人的干细胞培养出人体的器官，或者是利用病人的干细胞，培养出病人自己的器官，叫私人订制，这就是比较理想的供体，而且反复可以做。这一课题目前仅处于理论证明阶段，还没有明确的结论说到底行还是不行，这是科学家们正在探索研究的一个问题。

通过基因工程方法改造动物器官进行移植已经积累了大量的研究案例，距离应用已更近了。2000年我们在国际上成功克隆第一批猪，当初只能用克隆的方法才能做基因敲除，为了做异种移植，首先就是找到克隆猪的方法实现克隆猪，到2002年的时候，我们课题组第一个通过采用体细胞基因敲除技术和克隆技术敲除了α—GAL基因，培育出首批基因敲除猪，把超急性排斥反应解决了，从2002年至今已经14年，取得了很大的进展，超级性排斥反应解决以后，急性排斥反应也是重点要解决的问题，目前我们已经做了在各种不同的基因、不同的组合的猪中做了实验，因为这种既有敲除，又有转基因技术培育的猪不能叫敲除猪，也不能叫转基因猪，这是一个组合，我们统称叫基因改造猪，它的心脏已经在猴子身上存活了900多天。从胰腺分出来一个小的细胞团，叫胰岛，用来治疗糖尿病，里面有β细胞，它在猴子上已经有400天，而且把猴子的糖尿病完全治好了。最近，我们在猪肾脏移植方面研究情况也不错，文章还没有发表，这些实验结果都非常鼓舞人心，因此，如果我们把这些猪养在干净的环境下，下一步就可以用来做人体实验，通过基因改造猪来实现器官移植。

中国实验动物信息网：大动物猪用于异种移植有哪些优势？ 科学界在其他实验动物的异种移植实验进展怎样？

戴 一凡：这个其实也是过去三十年不断争论、不断探索得出的结论。最早80年代、90年代很多临床医生为了救病人，采用的肝脏、肾脏移植是从猴子、狒狒身上来的，那时引起了很大的争议，特别是动物保护协会的人，他们认为猴子是受保护动物；其次猴子体型非常小，狒狒属于比较大的，但最多也就是三十几公斤，真正适合人用的供体应该是黑猩猩和大猩猩，这个非常稀有，而且也是受保护动物；再有猴子的繁殖率低，一胎一仔，且长大成熟可能需要十几年的时间，不管是从速度上、经济效益上来讲，猴子饲养成本是非常高的，数量上也非常有限；而最大的问题其实是安全性的问题，猴子跟人相对来说更相近，它的很多病毒会跑到人身上，或者和人的病毒进行重组会产生很多未知的、非常厉害的病毒，我们现在知道的就有艾滋病毒HIV、埃博拉病毒病等，这些虽然是人的病毒但主要是寄生在猴子身上，一有机会就会传到人身上来，这个构成了很大的风险。因此，科学家的聚光灯逐渐集中到猪的身上，将猪这种大动物作为异种器官移植的移植对象。

通过多年的研究，现在也证实猪作为异种器官移植的研究对象是具有多重优势的，其器官与人体器官形状、大小相似，生理性质相近，管道分布和动力输出类似，血型抗原与人类也相近。而且繁殖效率非常高，一胎可十几个，且饲养一年就能长到很大的个体，生长周期短。另外，动物保护协会目前也没有提出反对的依据。再者，猪跟人相对来说距离比较远，在安全性上有一定的保证，它的内源性病毒和人的杂交机会比较低，我们平常听说的猪流感，其实不是猪本身的病毒，是人的病毒寄居在猪上再传给到人身上，这些属于外源性的病毒，完全可以通过非常干净的环境把它排除掉。我们主要担心的是内源性的病毒，存在基因组上去不掉的病毒。

中国实验动物信息网：当前，在猪的异种器官移植研究中存在哪些难题？

戴一凡：以动物为供体的器官移植，需迈过三道坎，即生理功能、人体排异反应和动物自身携带的病毒风险。

在过去14年间重点是解决免疫排斥反应，叫急性排斥反应，我们基本上把心脏、肾脏、胰岛这些大的器官的免疫排斥反应解决了。但现在别的器官还有一些问题，比如像肝脏、肺，他们本身比较难也比较复杂，人做肝移植，不但是用来做解毒，肝脏除了解毒功能它还有其他一些代谢的功能，包括合成白蛋白、合成凝血因子、肝脏的脂肪代谢，对人来说也是非常重要的，比如脂肪的转运，这些是以肝脏做为中心的，而猪的这些产物和人的不是很匹配，所以单单用猪的肝脏来提供这些功能的话，可能效果会很差。因此除了免疫排斥反应以外，它的生理功能的匹配问题，也是猪的异种器官移植研究中要解决的难题。

还有携带的危险病毒问题，包括两个部分，一是外源性的病毒，比如人的感冒病毒、人的其他病毒都是可以去掉的，因为我们可以把猪养在非常干净的环境来检测，一旦有这样的病毒我们就把这个猪处理掉，那以后也不会感染到人，这个比较好解决。第二是内源性病毒，目前看来也是没有太大的危害。据了解，最近美国一个实验室的课题研究中，就能把内源性的病毒都敲掉了，这也证明了我们有各种手段来消除这些内源病毒的危险性，所以现在我觉得不管是外源或内源性病毒这都不是难题。目前来说肝脏、肺器官移植还是一个难题，可能需要用其他的方法来解决，比如用人源化器官来解决这个问题。

中国实验动物信息网：新的CRISPR/Cas9基因编辑技术给供体猪（基因改造猪）研究带来了哪些突破？

戴一凡：有了CRISPR/Cas9基因编辑技术以后，我们现在做这个基因改造猪的效率大大增加了。我们2000年做α—GAL基因敲除的时候用了整整3年时间，就只敲除一个基因，现在用CRISPR/Cas9技术，敲几个基因仅几个月就可以做到。通过这个技术我们也发现如果能把猪的另外两个糖分子也一起敲掉的话，效果会更好，美国一实验室已经有了三基因敲除的猪，三个糖分子敲掉后，发现猪的细胞和人的抗体几乎没有结合，证明人目前存在对猪的抗体主要是靠这三个糖分子，这是一个非常有趣的结果，也是因为CRISPR/Cas9技术，让我们知道了可以进一步修饰这个猪，把它变成非常低的免疫排斥性，这个目前我们也在做，包括敲除猪的组织器官，还有它的皮肤、瓣膜都可以用在临床上的话，那么以后临床上就不需要用人的皮肤来做移植了。

中国实验动物信息网：您刚刚提到在肝脏、肺方面猪的供体是比较难突破，那么现在有没有一些更好的解决方案？

戴一凡：现在肝脏供体方面有不同的方案，比如说人源化的肝脏是其中的一个方案，还有一种方案就是在建一种人猪杂交的肝脏，这个肝脏既有猪的细胞又有人的细胞，就是用猪的干细胞和人的干细胞混在一起，这样的嵌合体肝脏有一个好处就是，肝脏到人的身上，人的细胞也在。这里有一个有意思的现象，就是如果在猪的肝脏细胞里面加一个自杀基因，一旦移植以后，就把这个基因激活，这个猪的肝脏细胞就自动消失了。如果猪的肝脏一直在产生猪的蛋白，对病人也不好，因为他会产生免疫反应，这是一个设想，也是科学家们正在探索研究的一个未知课题。肺就更难了，目前美国做了大量针对肺的基因改造猪，但是效果都不好，因为肺是非常娇嫩的器官。现在雾霾导致肺癌发病率显著增加，国内以后的肺移植估计也会大大增加，可能需要大量肺移植，我预期肺供体可能还是必须走人源化的办法来解决。

中国实验动物信息网：您认为我国供体猪（基因改造猪）异种移植真正走向临床试验（应用）还有多远？未来还需要攻克哪些问题？

戴一凡：其实现在离临床已经很近了，就是一个超洁净的养殖环境问题，我们现在有现成的基因改造猪做胰岛移植，如果有超洁净的环境，就可以把猪养在里面，两年以后就可以用在临床上了。

湖南中南大学湘雅医院的王维教授已经做了几例胰岛的移植在病人身上。他们建有超洁净的猪舍，所以他的猪的供体应该是很干净的。不过王维教授用的猪供体，不是我们认为最好的基因改造猪，他是用了野生型的猪。另外，他们现在只通过了一个三类医疗技术的许可，没有通过药监局的CFDA审批，所以基于以上一些原因，他们不能大规模地进行猪胰岛在人体上的移植。但是不管怎样，至少已经在临床上应用了。

中国实验动物信息网：请您展望一下未来器官供体的情况？

戴一凡：如果我们能够顺利把这些动物供体应用到临床，那么供体就不会出问题，以后用猪的胰腺做供体那应该是没有问题的，我们可以繁殖大量的供体猪，这完全取决于我们怎样把猪饲养的更好、怎样研发出更好的免疫抑制方案，还有就是建立超洁净的环境，再有是CFDA或者SFDA的审批程序问题，这就是我们下一步要做的事情。如果以后人源化能做出来的话，是非常理想的，那未来器官供体紧缺问题也就能更好的解决。