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模型制备

小型猪胃溃疡模型

2016年10月24日 浏览量: 评论(0) 来源:《小型猪医学研究模型的建立与应用》 作者:陈华主编 责任编辑:yjcadmin
摘要:消化性溃疡是指胃肠黏膜被胃消化液自身消化而造成的超过黏膜肌层的组织损伤,消化性溃疡可发生于消化道的任何部位,其中主要以胃和十二指肠较为常见,即所谓的胃溃疡和十二指肠溃疡,其发病病因、临床症状及治疗方法基本相似,明确诊断主要靠胃镜检查来确诊。

消化性溃疡是指胃肠黏膜被胃消化液自身消化而造成的超过黏膜肌层的组织损伤,消化性溃疡可发生于消化道的任何部位,其中主要以胃和十二指肠较为常见,即所谓的胃溃疡和十二指肠溃疡,其发病病因、临床症状及治疗方法基本相似,明确诊断主要靠胃镜检查来确诊。胃溃疡是消化性溃疡中最常见的一种疾病,胃溃疡发生主要与胃十二指肠黏膜的损害因素和黏膜自身防御修复因素之间失平衡有关。幽门螺杆菌感染、非甾体抗炎药(NSAIDs)如阿司匹林、胃酸分泌异常是引起溃疡的常见病因,胃溃疡多发于胃角和肖窦小弯处。胃酸和胃蛋白酶是胃液中非常重要的消化液,胃酸为强酸性物质,具有较强的侵蚀性;胃蛋白酶具有水解蛋白质的作用,可破坏胃壁上的蛋白质。然而在这些侵蚀因素的存在下,胃肠道仍然能抵抗和维持黏膜的完整性及自身的功能,其主要原因是因为胃、十二指肠黏膜还具有一系列防御和修复机制。正常情况下,胃和十二指肠黏膜的保护机制,足以抵抗胃酸及胃蛋白酶的侵蚀。但是,当某些因素损害了保护机制中的某个环节就可能发生胃酸及蛋白酶侵蚀自身黏膜而导致溃疡的形成。当过度胃酸分泌远远超过黏膜的防御和修复作用时就可导致溃疡发生。近年来研究表明,幽门螺杆菌和非甾体抗炎药是损害胃肠保护机制导致溃疡发病的最常见病因之一,胃酸在溃疡形成中起着非常关键的作用。此外,药物、应激和激素也可导致溃疡的发生。

典型的胃溃疡活动期常分为四层:第一层为急性炎性渗出物,由坏死的细胞、组织碎片和纤维蛋白样物质组成;第二层为以中性粒细胞为主的非特异性细胞浸润所组成;第三层为肉芽组织层,含有增生的毛细血管、炎症细胞和结缔组织的各种成分;第四层为纤维样或瘢痕组织层,可扩张到肌层,甚至达浆膜层。由于内镜下活检取材只能达黏膜层或黏膜下层,通常不能观察到典型的溃疡四层结构,其病理组织上主要表现为黏膜层炎症细胞浸润,固有膜内有以淋巴细胞和中性粒细胞为主的炎症反应或肉芽肿形成。胃溃疡症状常不典型,可表现为腹痛或腹部不适,大部分会出现各种消化不良的症状,但是有的也无任何症状,直至出现并发症,其常见的并发症主要有出血、穿孔、幽门梗阻、癌变等。

随着人类社会的不断发展,竞争越来越激烈,人们受到各种高压因素的影响,患有胃溃疡的比例不断增多,如何解决和治疗胃溃疡疾病是摆在我们面前的一个挑战。为了搞清其发病机制,提高疾病的治愈率,人们越来越多地关注于人类消化系统疾病动物模型的研究。由于小型猪的营养吸收和胃肠道结构等方面与人类比较相似,因此,用小型猪制作的胃溃疡模型与其他物种动物模型相比具有独特的优势。猪胃溃疡模型主要分为自发性和诱发性两大类。

1.自发性胃溃疡模型  自发性胃溃疡主要是由于胃内分泌的胃酸和胃蛋白酶异常过多,造成胃黏膜破坏所引起的一种溃疡现象。自发性猪的胃溃疡通常可由传染性胃肠炎和猪霍乱病毒性疾病激发而产生。随着养猪业向大型化方向的发展,猪患胃溃疡的病例急剧增多,这也给人们提供了大量研究猪胃溃疡的良好模型动物。由于猪是单胃动物,且具杂食性,所以其多发性胃溃疡的特点与人比较相似,具备作为人胃溃疡疾病模型的良好条件,可为人的胃溃疡疾病研究提供良好的模型。

小型猪自发性胃溃疡模型从离乳到成年均可发生,其发病后的临床症状和病理学特征与人类比较类似。易发部位为胃食管部,其发病症状与很多人的胃溃疡临床表现比较相似。猪与人都属于杂食性动物,且为单胃,胃内黏膜结构、饮食习惯和生理特点与人非常相似,是一种较好的人类胃溃疡疾病动物模型。猪食管下端括约肌受神经和体液因素的调节。人的逆流性食管炎(食管溃疡)受消化道激素特别是胃泌素的影响,猪发生胃食管部溃疡时,通过肉浸出物负荷试验显示胃泌素分泌降低,从这一点上也可以看到它和人的胃溃疡临床表现具有相似性。

胃部病变多发于不分泌胃酸的贲门部周围靠近食管的部位,很少发生在胃酸分泌的部位。病变部位的上皮性变化通常为角化亢进,弥漫性溃疡、穿孔性溃疡或溃疡治愈后会残留瘢痕,病变沿食管部黏膜纵向走行,形成放射状的粗糙的皱褶,弥漫部固有层乳头受到损伤,血液渗出,不仅病灶面融合、扩大,而且向深层侵蚀直至黏膜肌层,最终形成溃疡。溃疡为椭圆形,半月形或月牙形,有的仅发生于食管周围,有的则遍及整个胃食管部。转入慢性化时,溃疡部在坏死的过程中,部分胃组织塌陷,溃疡活动部分开始纤维化,胃壁的坏死沿着水平方向发展,也同时沿垂直方向经过肌层,直向浆膜下发展而成为腹膜炎。胃底部的溃疡多局限在黏膜的隆起部或黏膜皱褶间的平坦部位。病变部位宽约0.2~0.5cm,长约4~7cm。

组织学观察,急性胃溃疡围绕贲门部的胃食管部的上皮细胞肿胀、肥厚且不规则,上皮表层角化程度不一致。固有层乳头肿胀,有炎症和出血现象,乳头塌陷或隆起深及固有层,固有层有炎性细胞浸润,溃疡坏死组织边缘可见淤血、肿胀或出血,致病微生物侵蚀溃疡的基底部,溃疡面被纤维坏死膜所覆盖。亚急性胃溃疡发生伴有结缔组织增生性硬化,在覆盖基底层的坏死组织下,活的细胞缓慢增殖。慢性胃溃疡,溃疡的基底部变硬,病变呈喷火口状,在坏死的基底表层下,有肉芽组织生成,这种肉芽组织含有炎性细胞。肉芽组织固着在硬痂皮上,溃疡边缘结缔组织出现萎缩。

 2.诱发性胃溃疡模型

(1)冰乙酸诱发胃溃疡模型:近年来,研究者发现使用冰乙酸灌胃可成功复制小型猪胃溃疡模型,用360ml/L冰乙酸给小型猪灌胃,3小时后和眼观察胃内壁隆起呈明显白黄色、严重缺血坏死状态,镜下显示胃溃疡组织黏膜上皮层损伤严重,部分区域黏膜上皮层完全消失,暴露出固有膜组织,该方法可较好的复制出小型猪胃溃疡模型,为进一步分析其病理学变化,揭示人类胃溃疡疾病发病机制提供一个良好的研究平台。

示例:

体重为8.5~11.5kg的中国农大小型猪4头,雄性。以2%戊巴比妥钠腹腔注射(1.5~2ml/kg相当于30~40mg/kg)麻醉。首先测量小型猪下唇至剑突下的食管长度,然后从口腔插入12Fr型号胃导管,插至长度超过食管长度2~3cm,由于动物处于麻醉状态,胃管通过会厌部,动物不能做吞咽动作配合而会有阻力,故操作者动作要慢,以防损伤会厌部。插好后为验证是否插入胃中,将胃管另一端插入水中,观察水中是否产生气泡,以排除插到肺脏的可能。然后使用20ml注射器分别推入95%乙醇、无水乙醇或36%的冰乙酸15ml(实际进入胃中10ml,胃管存留5ml),造成局部溃疡损伤。

实验分为三组:灌注95%乙醇小型猪1头;灌注无水乙醇小型猪1头,灌注36%冰乙酸小型猪2头,灌注后3小时取材。动物安乐死后剖腹取胃脏,沿胃大弯剖开暴露胃内壁,用肉眼观察胃内壁与周围正常胃组织(呈粉白色)区别明显的片状溃疡面。取红色炎性变化的胃组织及正常胃组织,经无水乙醇固定,石蜡包埋及冷冻切片,用HE染色,在普通光镜下观察与照相。

实验结果显示,95%乙醇灌胃后,幽门附近胃黏膜皱襞仍完整,黏膜色淡红,表面光滑,局部显示轻微充血、水肿和深红色。镜下显示胃黏膜上皮和胃小凹完整,但有部分上皮肿胀,出现轻微损伤。无水乙醇灌胃后,幽门附近胃黏膜皱襞仍完整,但黏膜发暗红的颜色深度和面积均比95%乙醇灌胃模型有明显增加。镜下显示胃黏膜上皮受损,明显变薄,但仍残留少量上皮组织,胃小凹变短,出现明显破损的溃疡面。36%的冰乙酸灌胃后,可见胃内壁隆起呈明显白黄色,呈严重缺血坏死状态。镜下显示组织黏膜上皮层损伤严重,部分区域黏膜上皮层完全消失,暴露出固有膜组织。灌胃1天后溃疡更为明显,溃疡面边界清晰可见。

(2)抗炎药物诱发胃溃疡模型:非甾体抗炎药物如阿司匹林、吲哚美心等一类具有消炎、解热、镇痛的药物,一般认为它可以通过破坏胃黏膜屏障,改变细胞膜的通透性,影响黏膜血流和细胞再生,抑制前列腺素等机制引起胃损伤。用小型猪以大剂量阿司匹林灌胃,使猪胃黏膜表面出血,还可以造成胃黏膜细胞严重脱落。如长时间进行药物灌胃就会出现胃溃疡样变。

(3)幽门螺杆菌诱发胃溃疡模型:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是从慢性胃炎患者的胃窦黏液层及上皮细胞中首次分离出,1990年肯定了Hp与慢性胃炎和消化性溃疡的关系。近年来研究表明,Hp与胃溃疡和胃癌的发生也有密切的关系。幽门螺杆菌感染是慢性胃炎及消化性溃疡发病的重要因素,其产生的尿素酶、磷脂酶、脂肪酶及糖基硫酸酯酶等均有破坏胃和十二指肠黏膜表面黏液层结构的作用,损伤其屏障功能。建模方法通常分两步进行,第一步是幽门螺杆菌感染实验,用于建立Hp感染动物模型的菌株为Hp国际标准菌株sydney strain 1(ss1)。SS1含有细胞毒素基因和空泡毒素基因。可采用固体或液体培养基,添加50mg/L脱纤维冻融羊血及万古霉素10mg/L,多粘菌素B 2500U/L,抗菌增效剂5mg/L,微需氧条件(体积分数为5%O2、8%CO2、80%N2)37℃下孵育72小时。动物接种的方法一般采用灌胃法,每次感染前先禁食12~14小时,用胃管灌菌液1.5ml,30分钟后给食,每周感染1次,共感染6次。感染动物的鉴定:取胃黏膜组织,做病理切片、黏膜涂片并分离培养。分离的Hp经三酶(尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶)实验和革兰氏染色镜检确定是否为SS1。第二步是当猪感染的幽门螺杆菌确诊阳性后,再持续感染幽门螺杆菌,通过胃镜检查确诊是否形成胃溃疡病变,从而建立小型猪胃溃疡动物模型。

3.急性消化性胃溃疡模型  该模型通常采用幽门结扎法建立急性消化性溃疡模型。幽门结扎术是Shay等(1945年)创立的一种简单而有效地建立胃溃疡模型方法,其机制主要是通过胃内酸性胃液积聚而导致胃黏膜损伤,此方法制作的小型猪胃溃疡模型,用于探索抗溃疡药和溃疡发生机制的研究。

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