大家好，这周我们继续眼睛的话题，都说眼睛是心灵的窗户，我们首先会看看这个窗户会出现一些什么问题，然后看看我们的斑马鱼和这些疾病有什么关系，最后再讨论一下斑马鱼技术能在此间产生的作用，敬请期待！

眼部缺损

眼眶缺损，指由眼部的恶性肿瘤、外伤导致的眼眶缺损范围可能包括眼球、眶内软组织和骨膜、眼睑，并常伴有面中部缺损。视神经裂缝闭合的失败是导致眼部缺损的主要因素，其特点就是这些裂缝会持续存在于虹膜、睫状体、小带、视网膜、脉络膜和视神经中。

据报道，在全世界盲眼儿童中眼部缺损占11.2％，也就是说每10000个新生儿就有0.5-7.5个人会患有该类疾病。已有数据表明，该疾病和PAX2、CHD7、OX2、PAX6、GDF6、YAP1  、OTX2、SHH、SIX3、FADD、MAF、ZFHX1B、RX、GDF3、MAB21L2、SALL2和ABCB6等基因上的突变以及多个染色体的畸变有关，但是巩固这结论的分子机制仍有待澄清。

眼缺损的斑马鱼模型为理解视神经裂缝形态提供了一个重要的范例，在斑马鱼上对与人类同源的基因进行突变（表1部分），可以观察到视网膜和晶状体的缺陷，从而为眼部缺陷疾病的机制研究和治疗进行参考。

小眼/无眼

上眼睑提肌无力是一种常见的慢性眼部肌肉疾病，俗称“小眼睛病”。小眼是指眼部轴向长度比同龄人至少相差两个标准偏差，无眼是指完全没有眼组织。虽然小眼/无眼的病因是复杂的，但是大多研究认为SOX2或OTX2基因上的突变是导致无眼的主要原因，而小眼的致病突变主要在CHX10，OTX2，PAX6，RAX，BMP4，GDF6和GDF3上。

人体中PAX6单倍体量不足是导致虹膜缺失的主要原因，但在极少数情况下也会导致小眼。在斑马鱼，二个PAX6旁系同源物——pax6a和pax6b，编码参与视网膜和晶状体的形成和分化功能的冗余蛋白质。对pax6b进行错义突变后的斑马鱼纯合子，在发育前期会表现出轻微的小眼表型。有趣的是，用吗啡啉沉默pax6a或同时沉默pax6a和pax6b都会出现身体变小、神经管增生、脑异常和小眼球等表型，结果很相似，但后者更严重。

而用TALENS介导的pax6a和pax6b的同时沉默，直接靶向旁系同源基因之间的保守序列，出现了小眼这一表型。这说明TALENS介导的基因破坏更有效率，同时还加强了对双等位基因和旁系同源基因组的编辑，这对于作用斑马鱼基因组中的重复基因十分重要。

独眼

独眼是一种罕见的症状，这是由于胚胎没有正常分化。这种症状最常见于动物，但少数人也会得。独眼的特征在于单个眼睛却拥有双倍的眼结构，在胚胎发生期间，眼睛的分裂发生和音猬因子(SHH)介导的中线的建立发生在同一时期。SHH的突变会导致中线建立出现缺陷，进而导致前脑无裂畸形和独眼的产生。

斑马鱼会表达3种哺乳动物SHH同源基因，分别是sonic you (syu), tiggy-winkle hedgehog (twhh)和 echidnahedgehog (ehh)。对斑马鱼进行syu和twhh功能的同时沉默，部分出现独眼表型说明斑马鱼有两个哺乳动物SHH的同源基因且功能类似。重要的是，近年来出现的一些技术可以通过节点产生可遗传的染色体编辑的斑马鱼。

青光眼

青光眼是一种发病迅速、危害性大、随时导致失明的常见疑难眼病,也是一种引起视神经损害的疾病。指眼内压间断或持续升高的一种眼病，持续的高眼压可以给眼球各部分组织和视功能带来损害，如不及时治疗，视野可以全部丧失而至失明。

青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，总人群发病率为1%，45岁以后为2%。尽管哺乳动物小梁网和斑马鱼环状韧带不同，通过虹膜角膜的液体流向也不同，但是整体组织的亚显微结构和流体稳态调节呈现出了保守性。

成年斑马鱼和哺乳动物有着相似的眼内压（IOP）分布，因此在斑马鱼上可以很好的研究青光眼的疾病风险。黑色素减少的斑马鱼突变体（遗传基础未知）可以轻微得升高眼压并导致虹膜发育不全，这是由于编码低密度脂蛋白受体2（LRP2）的基因发生隐形突变所造成的，具体表现有慢性高眼压造成的眼睛放大，视网膜扩张和视觉神经损伤等。

角膜营养不良

人类遗传性角膜营养不良虽然少见，但是可以引起角膜失去透明性造成明显的视觉受损。在受精后6 个月时，斑马鱼的角膜含有人角膜中的所有五大层，大量编码导致人角膜营养不良的蛋白，包括转化生长因子B1（TGFB1），角蛋白（keratin）和角膜硫酸角质素蛋白聚糖（corneal keratan sulfate proteoglycan）的基因在斑马鱼上都有。重要的是，有些人角膜营养不良连锁基因显示出在斑马鱼角膜保守的表达，包括François–Neetens雀斑角膜营养不良基因PIP5K3。

人类基因Keratocan（KERA）编码的富含亮氨酸的蛋白多糖对维持角膜透明至关重要，而斑马鱼同源的zKera在幼鱼阶段广泛表达在脑和眼组织，成年后对维持角膜的透明度和结构的也至关重要。人LAMA1基因编码的是在角膜缘上皮干细胞（LESCs）高度表达的重要基底膜蛋白。而有趣的是，斑马鱼眼组织功能的同源基因LAMA1的丧失会导致成年斑马鱼角膜发育不良。

白内障

透明晶状体和角膜共同作用，是将光聚焦在视网膜上的良好的折射元件。白内障是指晶状体出现混浊，并成为了全世界可预防性失明的首要原因。虽然白内障在大多数情况下是于年龄相关的，但也可能有遗传和环境的因素，大约10万活产婴儿中就有2-3个患有先天性白内障，且往往在第一年中表现出，但是许多情况下的致病基因仍不是很清楚。

影响斑马鱼晶状体的几个突变都有文献发表过，主要是受到cdipt（磷脂合酶）基因的影响导致晶状体不透明化（LOP）突变，进而扰乱晶状体纤维分化导致视网膜光感受器退化而引起白内障。大量的斑马鱼诱变筛选已经确定了更多导致晶状体缺陷突变的基因，比如编码晶状体蛋白，连接蛋白，水通道蛋白，串珠灯丝蛋白和热休克因子的基因。这些蛋白质在维持晶状体和角膜的透明性和屈光力上非常重要。

人类LAMB2的突变会导致严重的肾脏疾病，也会导致多个眼部缺陷，包括晶状体畸形及白内障。同样的，在斑马鱼上的lamb1和lamc1基因突变也会导致视网膜分层和晶状体缺陷，包括视网膜内的晶状体异位，晶状体囊膜完整性损失，以及晶状体碎裂等表型，说明了层粘连蛋白在晶状体发育和结构完整性中的重要性。

此外，外依赖性基质的肌球蛋白动力学也有助于晶状体的细胞骨架组织构建。最近有研究表明，肌球蛋白分子伴侣UNC45B的杂合突变与先天性白内障有关。编码人类UNC45B蛋白质的基因注入到纯合突变的斑马鱼胚胎中，突出了通过新的治疗靶点治疗眼部病症的可能性。

无虹膜症

无虹膜症眼球内的许多结构产生变异，包括角膜、房角、晶状体、视网膜以及视神经等，而这些变异都有可能造成视力低下，而视力低下的结果就形成眼球震颤而且非常怕光。此先天眼畸形和人类PAX6单倍型不足和的PAX6下游染色体畸变有关。有趣的是，SIMO（PAX6的顺式调节元件）受体的表达在晶状体中十分明显，斑马鱼研究表明了这种保守的顺式调控元件在斑马鱼眼发展的重要性。删除斑马鱼PAX6基因座中的SIMO元件导致了晶状体中Pax6标记表达的完全废除，这表明SIMO增强子元件是眼部发育过程中保持组织特异性表达重要的推动者。

白化病眼和相关综合症

白化病眼（OCA：影响到眼睛，皮肤和头发）和眼部白化病（仅影响眼睛）是黑色素合成缺陷或广泛范围内表型隐性色素异常造成的。OCA类型1和3与酪氨酸酶（TYR）和酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）的突变有关，而这两者都是直接参与黑色素合成的。OCA类型2与OCA2上编码细胞跨膜蛋白的基因发生突变有关。OCA类型4和6分别由SLC45A2和SLC24A5的突变引起的，其编码细胞膜相关转运蛋白。OCA7型是由于C10ORF11基因突变引起的。

在斑马鱼上沉默相关直系同源基因，如tyr (TYR), oca21p (OCA2), tyrp1a and tyrp1b (TYRP1), slc45a2(SLC45A2), slc24a5 (SLC24A5)或c10orf11 (C10ORF11)基因就会导致眼睛中黑色素的减少或缺失，将其进行光曝露可以得到不同的视觉测试反应，对比OCA患者眼睛色素减退的不同程度，可以将斑马鱼的眼睛和人类疾病模型一一对应起来。

多个斑马鱼突变体已被确定可用于因RPE功能缺损而引起的视觉缺陷上。vps39突变鱼指的是斑马鱼VPS39同源基因突变的鱼，这个基因编码的蛋白质协调囊泡融合和运输。vps39突变后呈现皮肤黑色素细胞和视网膜色素上皮的色素减退，并导致内脏器官缺陷和先天免疫功能缺陷等。

勒伯尔先天性黑蒙症

勒伯尔先天性黑蒙症（LCA）是一类具有临床和遗传异质性的遗传性疾病，主要体现在早期视网膜营养不良。目前至少有15个基因和LCA相关，包括CEP290，RPE65，CRB1，KCNJ13，GUCY2D，AIPL1，CRX，IMPDH1，LCA5，LRAT，RD3，RDH12，RPGRIP1，SPATA7和TULP1。

将会导致早期视觉功能障碍的斑马鱼同源基因gucy2f进行沉默后，可以看到明显的外节和感光层损伤。用吗啡啉沉默中心体蛋白290 kDa（CEP290）会导致细胞内转运延迟和视力下降，词表型和LCA人类患者一致。重要的是，将N-末端重建的CEP290突变体注射入斑马鱼可以挽救视觉功能，可以作为此潜在治疗方法的支撑证据。斑马鱼直系同源基因CRB1的突变会导致严重的角膜缺损，相比之下，显得比在人的角膜LCA的变化更加明显。

色素性视网膜炎

视网膜色素变性是眼科中的一种疑难疾病，被称为不治之症，是原发于视网膜营养不良的一种遗传性慢性眼病，多累及双眼，国内患者约30万，全世界约300万，其临床特点表现为早期夜盲、视野向心性缩小，最终呈管状视野，双目失明或频临失明，在失明眼病中占有相当大的比例。

性连锁遗传基因位于X染色体短壁一区一带及二区一带，是RP中最严重的形式，特点是早发性和视力减退。用吗啡啉在斑马鱼上沉默人RP2同源基因rp2会出现小眼、视网膜层压缺陷和包括外节缺失、大量视网膜细胞死亡和视网膜变性等在内的感光体形态异常等表型，与人X染色体连锁的RP特征一致。

神经酰胺激酶样基因（CERKL）的突变与患者出现严重的视网膜变性有关，而斑马鱼的cerkl蛋白质可使视网膜细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡。将斑马鱼cerkl沉默后会导致杆状和视锥光感受器变性而增加视网膜细胞的死亡。此外，同源基因c2orf71的突变（对应RP54），会导致光感受器外节缩短，并导致视觉响应功能衰退。在斑马鱼模型上进行模拟这些人类RP相关表型分立，在确定RP致病的人类基因上是非常宝贵的。

血管疾病

斑马鱼在眼部血管疾病研究上相较于小鼠的优势就是——血管的透明性。此外，斑马鱼上的希佩尔林道（VHL）同源基因vhl的突变，会导致脉络膜和玻璃体血管网络的增加，并出现包括视网膜血管渗漏在内的全身缺氧反应，并病变至整个视网膜层，使视网膜神经层和视网膜色素上皮细胞脱离，此表型与VHL患者相一致。重要的是，低氧诱导的mRNA的过量表达与VHL肿瘤抑制基因的失活高度相关，使斑马鱼模型为缺氧诱导的病理性血管发生的研究的临床相关性的重要标志。

眼部疾病基因治疗方法是遗传性眼病治疗中最有前途的治疗疗法，给药途径可以是局部也可以是全身。从腺相关病毒（AAV）衍生的载体，由于尺寸小且具有在体内有效地转导视网膜细胞类型的能力，而最常用于眼部基因的递送。

小分子药物治疗手段

最近，一种定量整体器官筛选方式结合带分子标记的高通量筛选仪器被研究来筛选能够提高胰岛素标记分子活性的化合物。在筛选了500 000个斑马鱼胚胎后，筛出了177个作为治疗β细胞缺乏糖尿病患者的药物。重要的是，部分这些候选物已经被批准，这样就可以加快药物的转化进程。

当前用于延迟眼部血管增生的疗法有激光手术和促血管生成因子的分子抑制剂疗法。一个小分子药物LY294002——PI3激酶抑制剂，在斑马鱼模型上筛选出来的，被确定为同时作用于眼睛发育和异位玻璃体血管生成。可以通过眼内注射来抑制血管新生，并对眼部系统无二次影响和视觉功能威胁，进而筛选出靶向无毒的治疗药物。

分子疗法;靶向治疗干预的分子途径

反向遗传学已被证明是描绘涉及在斑马鱼眼发育和疾病典型信号通路的作用的有效方式。眼部缺损与视神经缺陷裂隙融合的部位凋亡活性增加有关。姜黄素具有广泛的药理作用，包括通过抑制胱天蛋白酶-3表达来实现抗凋亡的作用。未来的治疗策略可以基于小分子药物来绕过那些会导致常见先天组织缺陷的基因。

感光再生疗法

成鱼的视网膜拥有强大的能力来更换受伤后失去了的神经元。数个病变范例已被用于研究斑马鱼的视网膜再生，包括光病变特异性破坏光感受器、玻璃体内注射神经毒素哇巴因来破坏神经节细胞和内核层和物理损伤造成的局部视网膜损伤等。在这些情况下，看失去的视网膜神经细胞的再生，视网膜层压正常化，和视觉功能恢复。

虽然一些遗传、分子和细胞生物学技术已被证明在理解斑马鱼视网膜变性和再生机制上是无价的，但大多数的方式是无法产生这种神经元细胞死亡和再生过程中动态视网膜图片的。光学相干断层扫描（OCT）是一种非侵入性的成像技术，在诊断和监测的人视网膜疾病中至关重要。研究已经证明，典型的OCT视网膜层和人类视网膜组织病理学之间有良好的相关性，有利于辨别眼睛的前部和后部段的重要特征。

重要的是，OCT也被用来测定在体内光诱导或哇巴因诱导损伤斑马鱼视网膜层压和感光体的损失，并在再生过程中监测动态形态学变化。这样，不仅能解决从视网膜神经纤维层到视网膜色素上皮细胞间的图像问题，而且能利用高分辨率成像的能力研究斑马鱼视网膜发育、损害飞动态过程，成为能同时提供表征视网膜退化病症和评估潜在治疗效果的装置。

参考文献：Th e zebrafish eye—a paradigm for investigating human ocular genetics

【杭州环特生物】中国首家斑马鱼生物技术服务公司（CRO），面向医药、化工、食品、环境等领域，提供药物研发、安全性评价、毒理学研究和生物医学研究等专业服务。