(一)皮肤毒理学研究中猪模型的价值

可采用多种不同动物研究局部给药后的有害效应，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠和家兔。在与人体皮肤的形态学和生理学相似性方面，猪远高于其他的实验动物。因理化性质和经皮给药区的差异，化学物在密毛动物皮中的经皮穿透力均较高，但人皮肤和无毛犬或裸鼠的皮肤穿透力并无明显相关性。与之对应的是猪皮肤在透过性和代谢性质方面与人更为相似，此外，与人体皮肤相比，哥廷根小型猪或家猪皮肤对不同物质穿透力的差异较小。另外，猪吻部可作为研究人唇部穿透力的体外模型。小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬以及猴等实验动物的皮肤(除掌区和跖区之外)与人体皮肤均存在独特的形态学差异，然而，小型猪和人的皮肤在一般形态学、上皮厚度、细胞组成、免疫反应性和细胞转换率等方面均较为相似。小型猪的皮毛薄，无色素层，为经皮研究的理想皮肤。在实验性接触性皮炎中，人和小型猪的皮肤在临床、组织学和免疫组化方面的相似性，均支持以小型猪为模型研究其免疫病理学机制和药理学干预手段。此外，大量研究业已证明猪模型非常适合于炎症性皮肤损伤和消炎治疗的研究。与毒理学研究中常用的背部皮肤相比，小型猪的腹部皮肤与人的皮肤在厚度和结构方面更为相似，但是，在腹部皮肤给药更难以操作，也更易发生交叉污染。小型猪皮肤与人体皮肤最主要的形态学差异，是小型猪皮肤含有与角质层过度角化增厚相似的鳞状表面。此外，两者在真皮血管形成和外分泌腺及旁分泌腺的出现率与功能等方面也存在某些差异。小型猪的皮下脂肪层一般均比人皮肤厚，同时也存在一定的个体内和个体间的变异性。猪和人的皮肤在形态学和生理学方面的差异(如皮肤表面和腺体的分泌)，则导致两者在皮肤表面微环境条件方面各不相同，如猪皮的pH大约为6～7，而人皮肤的pH大约为5。

(二)小型猪经皮毒性研究方法

1．供试品的给予  小型猪的经皮给药，可应用于急性和反复给药经皮毒性研究，经皮吸收研究，皮肤光毒性研究和皮肤光致敏性研究。受试物的特性(理化性质、剂型)和研究的目的(给药区的大小和部位、给药频率、研究期限)，均可能影响敷药方法的选择。受试物的敷用方法，基本上分为开放式、半封闭式和封闭式三种。开放式敷药适用于皮肤穿透快或在皮肤形成极薄胶膜的受试物，尤其是在敷药区面积较大时。半封闭式或封闭式敷药时，以纱布或铝箔将受试物固定于皮肤上，以免受试物的损耗或污染其他皮肤区和环境。应用Finn盒注入固体材料、半液体制剂或贴片等受试物，则属于特殊性的封闭式敷药方式，可用于在规定的敷药面积内敷用一定量的受试物。这种设计适合于比较不同化合物或制剂在同一动物中的局部效应。受试物的敷药部位一般为背部皮肤，而小型猪的吻部上方给药则可用于研究抗癌药物对皮下的脑神经潜在神经毒性。为了确保皮肤较好地接触受试物，必要时应当在试验开始前至少1天剪去被毛，并在研究期限内以固定的间隔期反复剃毛。建议在经皮反复给药研究中每次敷药后以微温水和柔性肥皂清洗皮肤，以清除残留的受试物。

2．小型猪经皮毒性研究的方法-非侵害性皮肤检查  除了通过标准的活体阶段临床观察、临床病理学和组织病理学方法评价全身毒性之外，经皮毒性研究中还需要特别关注敷药部位的局部反应。这些局部效应可通过研究期限内的肉眼观察法予以评价，并按照红斑和水肿等的严重性进行效应的分级。其他的局部效应，如鳞屑、痂皮、皮脂腺分泌物、糜烂、溃疡、水疱、大疱、苍白、色素沉着性改变等，则可通过其外观、部位、分布和大小进行适当地捕述。因为皮肤反应的肉眼评价法在不同的研究以及不同的观察者之间可能并非完全一致，所以必要时应当采用非侵害性的测量仪器定量评价局部的处理效应。例如，以比色计反射率测定法确定皮肤的光学性质，可用于定量皮肤发红的程度。皮肤的厚度、密度，以及表皮和真皮的水肿等改变，则可通过高分辨率超声检查法予以检测。这些方法均优于常规的观察法，尤其是在比较不同的受试物时和在研究期间检测皮肤改变的不良后果时。其他的非侵害性评价方法则包括：以蒸发计测量皮肤损伤所导致的水分透皮损耗量，以激光多普勒血流测定仪检测皮肤血流量和皮肤血管的收缩性。

3．小型猪经皮毒性研究方法-侵害性皮肤检查和死后检查  通过局麻或全麻后的皮肤活检，可评价药物处理相关效应的变化时程或比较不同受试物的处理效应。然而，在标准的经皮毒性研究中，这些信息仅可来自于终末尸检；若采用中期剖杀，即需另外补加动物。经皮毒性研究中的皮肤活检或尸检，可用于测定细胞的增殖指数、细胞凋亡速率和细胞周期时相，并作为药物毒性和(或)药效的替代性评价标志物。检查时，应当首先制备单个表皮细胞悬液，再以适当的染料染色，最后激光扫描流式细胞仪进行评价。检查结果也可与组织病理学评价结果进行相关性分析。此外，也可制备皮肤活检或尸检样品的冰冻切片，再以特殊的抗体(如抗白细胞CD45抗原)染色，用于评价受试物所诱发的皮肤炎症。若需要检测皮肤中的免疫标记炎性浸润细胞，则可通过激光扫描流式细胞仪进行评价。

组织学方面，角质层损伤的程度，表皮／皮内损伤的类型，皮肤表皮连接层完整性的丧失，浅表真皮毛细血管袢膨胀和充血的程度，表皮下、中层真皮和深层真皮中水肿、出血、炎症细胞和纤维增生的有无，以及皮下组织的血管性和炎症性的改变，均可用于评价受试物经皮给药的刺激性和腐蚀性。

(三)小型猪经皮毒性研究的注意事项

1．受试动物  体外研究显示，小型猪皮肤对受试物的通透性随动物年龄而逐渐增加，并可能与皮肤成分的改变和毛囊向深层生长有关。另外，受试物的皮肤通透性增加也可能是因感染或皮肤的机械性损伤(如动物的打斗、抓搔、剃毛或清洗过度)所致。故此，建议在开始敷药前彻底检查皮肤，以剔除皮肤已破损的动物。

2．饲养和环境条件  从动物福利方面考虑，小型猪的群养要优于单养。但是，群养可能引起动物间的争斗，并可能导致动物因皮肤损伤而不得不将其从研究项目中剔除，并进而影响整个研究项目的可靠性。故此，小型猪的经皮毒性研究中应当采用单养法。猪并不能像人那样出汗，而是采用血管收缩／血管舒张、外部冷却(如用水冷却)等方式调节体温。故此，环境条件改变引起的皮肤表面温湿度的差异，可能会影响局部给予受试物之后的吸收。经皮吸收和毒性研究中，需要确保动物设施环境的恒定。

3．受试物的剂型  受试物的剂型可能严重影响局部耐受性或全身耐受性。随着受试物的理化性质和剂型的差异，快释或缓释制剂可能影响受试物在皮肤和全身循环中的动力学特性，并进而影响到其毒性效应。此外，制剂的成分也可能诱发局部有害效应甚至于全身效应。采用乳膏、软膏或高黏滞性溶媒开展经皮毒性研究时，可能出现皮肤炎症体征，甚至还出现于安慰剂对照处理组动物中，此时即需要暂停给药或提前终止给药。但是，目前尚不清楚此种效应究竟是皮肤功能障碍引起的表皮封闭所致，还是像有机溶剂给药时那样是因为去除了保护性的脂肪层／分泌物层所致。虽然人皮和猪皮对褪黑素的通透性相当，但是，当以脂肪醇为通透性增强剂时，两者对褪黑素的通透性仍存在定量差异。

4．给药步骤  剃毛和清洗敷药部位时，应当小心谨慎，以免损伤皮肤，并尽可能地减少非处理处的皮肤、给药设备和环境的潜在污染。损伤皮肤可能会增加受试物的全身暴露量，进而加重皮肤的不良反应。皮肤封闭给药，则可能对水合作用、表皮的脂肪成分、皮肤表面的温度、物理屏障和微生物屏障的功能、皮肤的微生物群落等产生实质性的影响，并进而影响到受试物的局部耐受性和全身毒性。尤其是在长期毒性研究中，皮肤受损的风险更高，封闭给药可能会加重背景性损伤和(或)感染，而不应将其当成受试物的原发效应。

5．非侵害性皮肤检查  定量评价局部处理效应时，给药处理前、给药处理过程中的检查区域应当相同，以便比较不同时间点的处理效应。应当用防水笔或防溶剂笔标记相应的检查区，以免混淆。

6．组织采样和组织病理学检查  尽管皮肤活检可适用于不同的研究项目，但是，炎症和继发的感染可能会限制随后的皮肤采样和活检区的给药处理。处死动物前采集样品时，应当标注特异性的皮肤改变，尤其是与血流动力学相关的改变(如红斑)，因为动物放血后皮肤会进一步地发白，也难以在尸检时发现局部脱色。

小型猪背部皮肤的标准样品分析结果表明，其自发的组织学背景损伤一般较为少见。猪背部的表皮相对较厚、结构规则、细胞更新率较低，常规的HE染色切片和标准长度的皮肤样品可轻易地识别和评价基底层的有丝分裂相、角质细胞退化和不同表皮层内的凋亡小体。在30％的未经过给药处理的小型猪中，其真皮层可见非特异性的、局灶性的炎症细胞浸润，平均浸润分级为低限性至轻度。

在小型猪的经皮给药研究中，其皮肤的病变谱均与人体内的病变相似。小型猪皮肤对受试物的耐受性，可能出现较大的个体差异，这种差异的原因并未完全弄清楚。故此，在解释此类个体差异时需要考虑动物的年龄、皮肤的类型(整体外观、分泌物、血液循环的范围)和条件(完整性，自发的背景改变／感染)。

7．毒代动力学评价／皮肤采样  考虑皮肤局部效应时，应当评价全身暴露量和皮肤暴露量的个体差异，因为每头小型猪皮肤的具体情况可能会促进(如皮肤糜烂和龟裂之类的损伤)或降低(如形成痂皮，受试物的沉积)受试物的吸收量。

8．污染  与经口给药或非经肠给药研究相比较，经皮毒性研究的毒代动力学分析中出现样品污染风险一般均较高，尤其是以高浓度的受试物处理大面积的皮肤时。血样的交叉污染，可能会高估全身暴露量；在出现全身性的不良效应的情况下，则可能低估对人类的潜在风险。此外，若对照样品中的受试物浓度达到可检出水平，则可能影响研究的质量和完整性。唯一切实可行的预防措施，是在使用对照组和处理组动物时将仪器设备和实验人员的着装严格地分开，或者至少需要尽可能地减少对照组动物或样品的潜在污染。为此，甚至还可考虑将处理组动物和对照组动物饲养于不同的动物房内。组织样品被污染后，极难测定表皮、真皮和皮下脂肪中的受试物浓度。皮肤中残留的受试物(尤其是来自乳膏制剂的受试物)，常常难以清除，即使是用胶带剥离皮肤也无法将其清除。故此，在皮肤尸检采样测定受试物浓度时，应当细心解剖，从皮下层开始，再逐渐深入到浅层皮肤，并需频繁地更换解剖手套和器具。