近日，国际分析化学领域的著名杂志《Analytical Chemistry》在线刊发表了中国科学院微生物研究所杜文斌课题组在H5亚型禽流感病毒快速定量检测的研究进展文章。何宏轩课题组的博士后胡奕和杜文斌课题组的徐鹏为该文章的共同第一作者。

H5亚型禽流感(如H5N1)是一种全世界范围的人畜共患病，严重威胁着家禽产业以及人类的公共健康。对禽流感病毒进行及时、定量和亚型检测，是快速诊断和疾病防控的重要基础。等温核酸扩增技术，尤其是环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，使核酸扩增可以在恒温条件(60-65 °C)下进行，是对传统PCR技术的重要改进，尤其适用于条件欠发达地区以及现场快速检测。数字等温扩增技术，通过将反应体系分隔为大小均一的大量反应单元，进行独立的单拷贝等温扩增，并基于泊松分布，对起始模板数量进行精确统计，在准确性、灵敏度和绝对定量(不依赖于标准曲线)方面有了革命性的改进，尤其适用于病毒载量的定量检测。因而，开发适用于禽流感检测的数字LAMP技术具有重要意义。

杜文斌课题组最近研发了一种界面打印液滴生成方法(Cross-interface Emulsification, XiE)(Xu et al., 2016, Anal. Chem. 88:3171-3177)。其原理是利用稳定流速注射液体的毛细管在油-气界面处的高频振动，利用在油-气界面的表面张力的周期性切割作用，实现均一液滴的制备。通过该方法，可快速连续生成大量皮升至纳升体积微液滴，平铺于96孔板容器底部形成液滴阵列。XiE技术不依赖于微加工技术，成本低、操作自动化程度高，非常适合于实现数字核酸扩增分析。前期的研究中，对基于XiE的数字等温LAMP扩增进行了初步研究，表明这一系统能够实现准确的核酸定量检测。在前期工作的基础上，与中科院动物研究所研究员何宏轩课题组合作，针对H5亚型的禽流感病毒的快速定量检测，开展了模型验证和禽流感真实样品的检测。建立了特异性的H5亚型禽流感病毒LAMP检测引物探针，首次验证了数字LAMP用于H5禽流感病毒检测的特异性、灵敏度和线性范围。研究结果表明，数字LAMP与实时荧光定量PCR，以及美国伯乐公司的QX200数字PCR系统的检测灵敏度和线性一致，具有良好的特异性和准确性。值得指出的是，相比于数字PCR和荧光定量PCR，数字LAMP表现出更好的抗抑制剂能力(如腐植酸、SDS等)，可以保证方法对没有充分除去污染物的野外或临床样品检测的可靠性。

流程图：利用XiE系统进行dLAMP定量分析h5n1禽流感病毒载量

原文摘要：Human infection with avian influenza A H5N1 viruses can cause severe diseases with high mortality rate, and continues to pose a significant threat to global public health. Rapid diagnosis is needed for identifying the types of influenza viruses for making timely treatment decisions. Here, we demonstrate absolute quantification of H5-subtype influenza viruses by digital loop-mediated isothermal amplification (dLAMP) on our recently developed cross-interface emulsification (XiE) method. Our results show that XiE-based dLAMP is highly specific and displays comparable sensitivity to Real-Time PCR (qPCR) and digital PCR (dPCR). Notably, dLAMP is more tolerant to inhibitory substances than PCR methods, and demonstrate similar detection efficiency to qPCR for real H5N1 samples. Therefore, it can serve as a robust and precise alternative to qPCR or dPCR, and is especially suitable for environmental and clinical samples with hard-to-remove contaminants. We believe that our dLAMP method offers great potential for rapid and accurate diagnosis of influenza and other infectious diseases.