异种移植一旦在临床上获得成功，不仅可以从根本上解决人源组织和(或)器官供体匮乏的问题，而且具有非常大的应用市场，有望成为未来生物医学领域的一项重要产品。因此，异种器官移植的基础研究已成为器官移植研究的世界性热点，且焦点主要集中于小型猪的遗传修饰领域。20世纪90年代以来，随着人们对异种移植排斥反应的发生机制的深入研究，以及分子生物学、基因工程等相关学科的飞速发展，使得通过基因工程手段对供体猪群进行遗传修饰成为可能，进而有望为异种移植提供理想的器官来源。

(一)猪的遗传修饰

如前所述，猪是人类异种器官移植最有希望的器官来源。为突破异种器官移植的免疫障碍，近几年，利用分子生物学和免疫学的理论及技术，人们把目光主要集中在转基因猪(transgenic pig)、基因敲除猪(gene knockout pig)和诱导受体的免疫耐受(immune tolerance)猪等这三个方面的研究。

1．转基因猪  如前所述，异种移植超急性排斥反应(HAR)的重要介导因素是补体的激活，补体调节蛋白在决定HAR的强度时扮演了重要的角色。因此，早期供体猪的遗传修饰研究主要集中于建立人类补体调节蛋白(hCRP)的转基因猪，如人衰变加速因子(hDAF)、膜辅蛋白或CD59等，从而达到减低或消除补体级联反应的目的。

1995年，McCurry等成功构建了hDAF转基因猪，将该猪的心脏移植给狒狒(术后不用免疫抑制剂)，在3例接受此转基因猪心脏的狒狒中，2例移植心存活长达数小时至十几小时，且没有发生HAR。组织学研究表明，3例移植心免疫损伤的程度明显轻于未转基因猪的移植心，此实验首次表明表达hCRP的猪源组织和(或)器官有望成为突破异种移植免疫排斥反应的第一道障碍，即HAR。

1996年，英国剑桥大学的White小组将hDAF基因导入猪体内并得到表达，并利用此种转基因猪的心脏和肺脏进行了人血浆活体灌注实验，结果表明这些转基因猪心脏和肺脏获得了抵御人补体系统对猪血管内皮细胞损伤的能力。

2000年，西班牙的Ramirez和英国剑桥大学的white合作，实施了转hDAF基因猪到狒狒的异种肝移植，接受hDAF转基因猪肝的狒狒存活达4～8天，可以维持正常的蛋白和凝血水平，均未发生HAR。

加拿大Western Ontario大学在1999～2002年共实施24例hDAF转基因猪到狒狒的肾移植实验，均未发生HAR，最长移植肾存活时间达75天，10例死于异种急性血管性排斥反应，14例死于与排斥反应无关的并发症。

美国麻省总医院进行了10例将转hDAF基因猪的心脏移植给狒狒的实验，采用去除抗半乳糖-α-1，3半乳糖糖基表位天然抗体、胸腺照射和眼镜蛇毒因子(CVF)诱导治疗，麦考酚吗乙酯(MMF)、抗CD154单抗、甲泼尼龙和肝素维持治疗，移植心最长可存活139天。

此外，人们还对其他补体调节蛋白(hCD46、hCD59)做了大量研究。Ryren等获得了转hDAF／hCD59基因猪，在心、肝、肾中表达hDAF和hCD59两种蛋白，但是表达量只有人同种组织的47％和45％。Shiraishi等用腺病毒介导hDAF／hCD59／hCD46三基因转染获得的猪肝，不仅能够有效地控制HAR的发生，而且还可部分抑制AR和CR的发生。美国MayoClinic医院报道了10例转hCD46基因猪到狒狒的心脏移植，采用一种临床可能接受的免疫抑制方案『抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗CD20单抗、FK506、西罗莫司和一种中和抗α-Gal抗体的静脉用药TPC]，结果令人鼓舞，移植心平均存活76天，最长存活时间达113天，仅3例死于排斥反应。

2．基因敲除猪  2002年，《科学》报道Lai等应用核转移技术成功地培育了α-1，3半乳糖基转移酶基因敲除猪，虽然只敲除等位基因上的一个α-1，3半乳糖基转移酶基因位点，但能够清除异种天然抗原的表达，为克服异种移植的免疫学屏障带来了曙光。

2003年，《科学》报道美国PPL Therapeutits Inc成功的构建了异种天然抗原半乳糖-α-1，3半乳糖糖基编辑酶(α-1，3半乳糖基转移酶)基因完全敲除的猪，随后美国麻省总医院进行了α-1，β半乳糖基转移酶基因敲除猪的肾脏或心脏移植到狒狒的临床实验，在此实验中采用了一种以抗CD154单抗为基础的免疫抑制方案，成功地克服了HAR，移植心存活时间显著延长(2～6个月，平均78天)。猪肾脏与血管化胸腺组织同时移植时，DXR／AVR显著延迟并减轻，移植肾最长存活83天，肾功能良好，动物死于心肌梗死。虽然这些结果给人极大鼓舞，但加拿大Western Ontario大学对α-1，3半乳糖基转移酶基因敲除猪到狒狒的肾移植实验却得到了不同的结果，他们采用两种临床可能接受的免疫抑制方案，大部分移植肾在16天内发生了较为严重的DXR／AVR。免疫学研究证明，诱导产生的抗非半乳糖-α-1，3半乳糖糖基表位的抗体也能介导严重的DXR／AVR。

α-1，3半乳糖基转移酶基因敲除猪的成功建立及其在猪→非人灵长类动物临床应用中所取得的成果，进一步增加了人们对猪→人异种移植研究的信念。人们开始探讨在α-1，3半乳糖基转移酶基因敲除猪的基础上进一步进行基因修饰或改造，以期建立更理想的供体猪群来防止免疫排斥反应的发生。

目前，主要进行的其他修饰包括用于降低超急性排斥反应和急性血管排斥反应的人补体调节蛋白CD46、CD55、CD59的转入和N-羟乙酰神经氨酸的敲除，以及用于降低血液凝集反应和炎症反应的血栓调节蛋白、组织因子通道抑制剂、ENTPDl(也称CD39)的转入等。

(二)PERV与异种移植病毒安全性研究

猪的PERV感染问题给异种移植的前景蒙上了一层阴影，使人们为此而感到迷茫。1997年Pateince等首次发现PERV在体外可以感染人源多种细胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注，人们担心带有PERV的猪的细胞或器官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成人源大流行?尽管在接受猪源、组织和器官移植的人体内，尚未发现PERV感染的证据。但是对于PERV潜在的病原安全性问题却不容忽视。

PERV在形态学和生化学上具有其他哺乳动物C型病毒的典型特征，但核酸杂交试验证实，来源于PK-15的C型反转录病毒与小鼠、大鼠、猫、地鼠和灵长类动物的C型反转录病毒明显不同，Patience和Tacke分别对来自PK-15的PERV进行蔗糖密度梯度离心，测得其蔗糖浮密度值为1.14～1.16g／cm。电镜照片显示病毒粒子的直径约为110nm。PERV为含有囊膜结构的单股正链RNA病毒，以整合的前病毒形式存在于所有的猪体中。至少有三个变种在体外培养、感染性和假模试验中能感染人体细胞，在感染细胞后RNA部分被反转录为DNA，DNA再插入到宿主细胞的基因组中，从而传递给后代，且可直接指导子代病毒粒子的生成。

PERVs可分为β反转录病毒和γ反转录病毒两类，具有传播风险的感染性PERVs属于γ家族，包括PERV-A、-B和-C。典型的γ反转录病毒PERV-A、-B和-C包含三个ORFs，分别为gag、pol和env基因，它们位于两个LTRs之间，还包括转录所必需的调节元件(图4-14)。PERV-A、-B和-C亚型在gng和pol基因上高度同源，但env基因却存在显著差异。这些区别反映了不同受体的特异性和对宿主的嗜性。PERV的RNA在猪的所有组织中均有表达。

图4-14  PERV病毒基因组示意图

PERV-A、-B和-C型前病毒基因组从5'端到3'端均包含三个大的开放阅读框，依次编码gag(种属特异性抗原)，pol(多聚酶)和env(囊膜蛋白)，三者位于两个长末端重复序列之间。该三种类型的PERV的env序列不同，与病毒粒子的包装信号有关

经分析不同的猪种和细胞株显示有30～50个PERV拷贝以前病毒的形式弥散地存在于猪的基因组中。大多数前病毒都不完整是由于其编码序列因突变或缺失而断裂成一个或多个ORFs。仅少数完整的全长PERVs能产生有感染性的病毒粒子。PERV拷贝数在不同的猪品系之间或同一品系不同的个体之间不同。迄今为止，在所有被检的猪种系中均鉴定出PERV-A和PERV-B的存在。一般而言，PERV-A前病毒拷贝数高于PERV-B拷贝数。大部分猪种系没有或含有低拷贝的PERV-C。

尽管在所有猪品系中均发现了PERVs的存在，但是在天然宿主体内没有发现其致病的迹象。因为在人源细胞中很难存活，所以它们也不大可能产生病变效应。尽管如此，PERVs有可能与相关反转录病毒一起产生致病性。PERVs与长臂猿白血病病毒(GALV)、猫白血病病毒(FeLV)或鼠白血病病毒(MLV)类似，均不可使其天然宿主致病，但可使新宿主产生肿瘤或导致免疫缺陷。GALV可能是在种间传播鼠内源性C型反转录病毒之后产生的。与此类似，FeLV可能源于啮齿类内源性C型反转录病毒。

起初检测到了小型猪肾细胞系和PK-15细胞系自主释放的PERV病毒粒子。相继发现丝裂原刺激的猪外周血淋巴细胞和新分离的猪胰岛细胞所释放的PERVs能够感染人原代细胞，比如上皮细胞和外周血单核细胞(PBMCs)。特别引人注意的是这些细胞代表了异种移植物和移植受者的受体的主要接触面。

假型PERV囊膜缺陷型鼠白血病病毒载体进行体外研究结果表明：PERV-A和PERV-B型特异性受体在人组织中广泛分布。最近发现PERV-A型人类受体。鉴定出两个相关的受体编码序列分别为HuPAR-1和HuPAR-2。两个同源性蛋白证实了所感染的病毒是PERV-A型而不是PERV-B或PERV-C型。这些在不同细胞类型中的表达更确切地表明人类各组织提供了一个更为大的可感染宿主范围。至今未鉴定出PERV-B型人类受体。PERVs可能具有突破种间屏障而感染同源受体缺陷的异源性细胞的能力。

当用小型猪的外周血单核细胞(PBMC)与人细胞系共培养时，从PBMC中分离出的嗜人性重组型PERVs具有相当高的病毒滴度。这些PERVs病毒基因组由PERV-C型的基因组骨架和PERV-A亚型的受体结合位点编码域组成。是否在猪体内或在原代细胞培养的过程中存在或产生了外源性病毒或者产生了PERV A／C重组型前病毒基因序列还有待考证。因此，PERV-C型与嗜人性的PERV的重组暗示了种间传播的风险性。

PERVs所带来的另一种风险是PERV与人内源性病毒重组，可能会产生新病毒和新的病原效应。人基因组中包含HERVs相关的γ和β反转录病毒序列。理论上，在有效感染导致HERV和PERV转录子共包装形成反转录病毒粒子时期，PERVs和HERVs可发生重组。然而，在实践中至今还没有实验证据证实体外发生这种重组的可能性。因此，尽管我们获得的体外实验资料有限，PERV和HERVs的重组可能预示了新的杂交内源性病毒产生的风险性。总之，PERVs具有致病的潜在性，至少在体外与其他的γ反转录病毒有许多共同的特征。

为了降低PERV的传播，许多降低或消除PERV的策略被陆续提出并尝试。其中包括施加抗反转录病毒药物、施加反转录酶活性阻断剂、施加齐多夫定和双脱氧肌苷药物、施加叠氮朐苷(AZT)、施加抗PERV抗体或PERV疫苗、RNAi技术等，但效果均不甚理想。目前正在研究的锌指核酸酶技术，初步结果显示出具有较好地PERV消除效果，但仍需进一步深入研究。

总之，通过选择合适的猪种系(特别是小型猪等优良品种)，利用基因工程技术改造动物、探究有效地PERV消除策略以及寻找合适的动物模型对PERV进行研究探索，可以把PERV种间传播的可能性降至最低，为以猪为供体的异种移植奠定基础。

(三)我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究

我国拥有丰富的小型猪种质资源，为医学实验研究和人类异种移植供体研究提供了丰富的材料，我国已经启动和开展了小型猪资源开发利用和异种移植的基础研究等项目，在PERV的研究领域取得了一定的进展。

1．中国特有小型猪内源性反转录病毒存在状况的调查  2003年，章金刚等率先在全国范围内开展了我国小型猪中内源性反转录病毒存在状况的调查，系统检测分析了PERV在我国小型猪中存在与表达情况。以4株猪源细胞为模型，建立了检测PERV整合存在和分型检测的PCR技术以及PERV表达的RT-PCR技术，并对其特异性、敏感性等进行了研究。采集了6个省市10个单位、5个品种、17个猪群348份外周血样品，根据通用的env基因分型方法，用PCR和RT-PCR方法检测PERV env-A、env-B、env-C在版纳小型猪、五指山猪、巴马小型猪、贵州小型猪、中国实验小型猪等我国主要小型猪基因组中的存在与表达情况。结果发现：从病毒存在的情况看，我国小型猪基因组中普遍存在PERV，其阳性率达100％。PERV的存在以B亚型最高(95.40％)，其次为A亚型(74.43％)、C亚型(30.46％)；从病毒的表达情况看，五指山猪、巴马小型猪中PERV-A亚型的表达率高于B亚型，但所有的样品均未检测到PERV-C型的表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看，小型猪基因组中不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA，而且都能够转录为RNA。

上述结果表明，我国小型猪外周血淋巴细胞基因组中存在PERVγ1亚群的A、B、C三种亚型，但仅有A、B两种亚型能够表达。PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在，预示着小型猪群中存在着不同亚型病毒重组的可能性。

2．小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞的研究  通过脂质体转染的方法，将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK293细胞中，对转染细胞进行压力筛选，并对其进行了PCR鉴定，培育得到G418抗性HEK293细胞(C418R293)。

将五指山猪、中国实验小型猪、巴马香猪、巴马小型猪及贵州香猪外周血淋巴细胞分别与C418R293细胞共培养，通过G418加压筛选，除去共培养体系中的猪外周血淋巴细胞，然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。

通过上述方法已成功建立了来自五指山猪、中国实验小型猪、巴马香猪、巴马小型猪及贵州香猪外周血淋巴细胞的猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞的模型，证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系。以上成果为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台，并可进行抗反转录病毒的药物筛选。

(1)猪内源性反转录病毒gag、env基因的克隆、表达及抗体的制备：分别设计合成了用于扩增PERV gag基因和env基因的引物，成功地克隆并鉴定了中国小型猪来源的PERVgag、env全基因。

PERV的gag基因片段包含一个完整的开放读码框架，由1575bp组成，编码524个氨基酸。来源中国实验小型猪的PERV gag基因序列与其他来源的同源序列相比较，有三个核苷酸存在变异，其中一个是位于N端第1054位的C→T的变异，另一个是位于N端第1180位的A→G的变异，最后一个是位于N端第1560位的A→C的变异。最终导致Gag蛋白的一级结构发生变异。

PERV的env基因含有一个完整的ORF，大小为1983bp，编码660个氨基酸，分型结果表明该克隆基因为PERV-A型。序列同源性分析显示，该env基因与法系大白猪来源的PERV-A1型囊膜基因同源性为97％，与欧洲小型猪来源的PERV囊膜基因同源性为82％。该env基因序列已提交GenBank注册，序列号为：AF507940。

分别实现了两个基因在大肠埃希菌中的表达及初步纯化，并免疫接种家兔，制备了相应的多克隆抗体；构建了相应的真核表达载体，采用基因免疫的方法接种BALB／c小鼠，筛选获得了特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株并对单抗进行了系统鉴定。该研究为建立PERV的免疫学检测方法奠定基础，猪内源性反转录病毒的囊膜区在毒株的分型及病原性上具有一定的意义。

(2)猪内源性反转录病毒全序列测定与功能分析：利用PCR及RACE技术完成了五指山猪、巴马小型猪及来源于HEK293细胞感染模型的PERV的全基因组序列测定，3个毒株的大小分别为8639bp、8595hp、8689bp。分型检测均为PERV-A亚型病毒。

通过序列比较及生物信息学分析发现来源于五指山猪的PERV(PERV-WZS)的5'UTR区中启动子及增强子的位置分别位于-67～+1及-97～-59之间。Env蛋白中有18个可能的抗原表位区，7个可能的糖基化位点。来源于HEK293细胞的嗜人293-PERV-WZS株与亲本病毒PERV-WZS同源性为94.6％，差别主要在5'UTR及gag基因。来源于巴马小型猪的PERV(PERV-BM株)的5'UTR结构与PERV-WZS株明显不同，可能是进化年代相对短的毒株。

采用DNAstar软件MegAlign模块Clustal法构建进化树，了解来源于我国特有小型猪的PERV与世界不同地区小型猪的PERV的进化关系。从进化树分析的结果来看，国内三种小型猪的PERV env基因的进化与A、B、C三个亚型有关，与宿主、分布地域关系不大，且PERV-A亚型与C亚型的亲源关系更近于B亚型。该研究结果为开展PERV的相关分子生物学研究、感染性病毒克隆与载体构建奠定了基础。

(3)PERV前病毒全长克隆的构建与新型载体的构建：目前已获得五指山猪PERV前病毒全长克隆，可运用生物信息学方法分析影响嗜人性PERV感染性和嗜性的区域。此外，将进一步运用PERV前病毒全长克隆来构建PERV感染性分子克隆，深入研究PERV感染与整合机制等。

PERV是以前病毒的形式整合存在于猪细胞基因组中，根据基因同源重组的原理，在PERV清晰的分子生物学背景的基础上，用其构建新型反转录病毒载体，对于转基因猪及PERV生物学特性研究具有重要意义。

以我国特有五指山猪(WZSP)来源的PERV和小鼠干细胞病毒(murine stem cell virus

MSCV)载体为基础，利用PERV的5'LTR与3'LTR及5'UTR加上gag基因的一部分(以利于增加病毒滴度，并将起始密码子ATG突变为TAG以降低组装形成野生病毒的概率)与3'LTR分别替换MSCV载体的相应区域，构建猪内源性反转录病毒载体，将其命名为PM-1和PM-2。且在PM-1和PM-2载体的多克隆位点插入GFP基因构建了PM-1-GFP-21和PM-2-GFP-1反转录病毒表达载体。将pPM-1-GFP-21、pPM-2-GFP-1转染PK15细胞后，通过PCR及Southern blotting进行鉴定，证实载体能够成功转移并表达外源基因，并且具有稳定整合外源基因至PK-15基因组中的能力。同时，对PM-1和PM-2载体的被包装能力进行初步评价，将pPM-1-GFP-21和pPM-2-GFP-1分别与pGag-Pol及pVSV-G三质粒共转染HEK293-T细胞，继而用细胞上清感染PK-15细胞，结果未检测到GFP基因的表达，分析其可能原因为异源的转录调控序列与结构蛋白包装质粒可能无法结合在一起，因而有必要构建与其反转录病毒载体同源的结构蛋白包装质粒来完成载体的正确包装。

此外，我们进一步在载体pPM-1-GFP-21的5'LTR下游插入了CMVie的强启动子，以增  强目的基因的表达，在载体pPM-1-GFP-21的3'LTR下游插入了HSVtk基因用以作为同源重  组的负筛选标记，成功构建了靶向载体pPCM1-tk。同时，载体pPCM1-tk含有载体pPM-1-  CFP-21的GFP基因，以及作为正筛选标记的neo基因。将该载体转染猪源细胞ST和SK-6  后，筛选得到同源重组的细胞，并利用PCR的方法检测同源重组的发生位点，证明了利用  PERV靶向载体构建转基因细胞的可行性。

(4)PERV感染人源细胞后蛋白质组学分析：PERV感染人源细胞后，细胞并不产生任  何形态学的改变或生长状态的改变，为了揭示嗜人性PERV感染人源细胞后究竟产生了怎样的分子效应，并探索其是否具有与其他γ群反转录病毒类似的致病性，我们运用比较蛋白质组学方法从全细胞水平上对嗜人性PERV感染人源细胞后的蛋白质表达的变化进行研究。

通过2-DE比较分析感染PERV的HEK293细胞与阴性对照HEK293细胞的总蛋白谱，采用高解析离子淌度质谱分析鉴定差异表达的蛋白，鉴定出10种差异表达蛋白，与对照相比，其中6个为上调蛋白，4个为下调蛋白。通过实时定量RT-PCR与Western Blot验证，证实差异表达结果可靠。这些差异蛋白参与信号转导、细胞凋亡、蛋白合成等生命过程，其中有数种蛋白与肿瘤的发生发展有关。该研究结果有望为深入研究嗜人性PERV与人源细胞的相互作用及PERV感染后的分子效应等提供一定的线索，也提示了PERV感染后可能会对细胞的生长、生理功能等造成影响，甚至存在潜在的致病性。

3．五指山猪PERV宿主范围及细胞嗜性研究  首先是构建PERV-WZSP-env的真核表达质粒，并向反转录病毒载体MSCVneo中捅入报告基因GFP，在辅助质粒Gag-Pol的协助下，三质粒共转染HEK293T细胞，转染72小时后收集培养上清，超离浓缩后用少量DMEM培养液重悬获得病毒粒子浓缩液，用于感染HEK293T、CHO、PK-15、Mv．1．Lu、RNK、BHK、NIH3T3、Vero、MDCK、FK-81等10种细胞，结果表明，五指山猪来源PERV仅可感染人源细胞、水貂细胞及猫源细胞，对小鼠、大鼠、仓鼠、非洲绿猴和Madin-Darby犬来源细胞均不易感，且对HEK293T细胞的嗜性最强，其次是水貂细胞Mv．1．lu，对猫来源的细胞FK-81嗜性最弱。初步说明，难以利用啮齿类等常用的实验动物来建立五指山猪来源PERV的体内安全性评价系统。

将得到的PERV-WZSP体外宿主范围与国外文献报道的其他来源PERV的宿主范围进行比较，发现五指山猪来源PERV具有较窄的宿主范围。为了了解导致PERV-WZSP与国外文献报道PERV-A型宿主范围差异的原因，我们将两株PERV-WZSP的Env氨基酸序列进行比对。发现它们在影响PERV宿主嗜性的关键区域之一的PRR区上存在三个氨基酸的差异，分别位于254位、266位和291位，在PERV-WZSP中这三个位点分别为丙氨酸、赖氨酸和丝氨酸，而在另一株PERV-A中该位点分别为脯氨酸、谷氨酸和脯氨酸。我们推测，这三个氨基酸的差异导致了两株PERV宿主范围的差异，但要证明这一点还有待于对PERV-Env分子特征进行深入的研究，因此，本研究也为探讨影响PERV宿主范围的关键分子提供了一些线索。

4．猪天然免疫分子APOBEC3F与PERV相互作用等相关研究  我们首先通过在PK15细胞中瞬时上调或下调猪APOBEC3F(pA3F)的表达量，发现PERV mRNA与反转录酶也出现同样的改变趋势，说明PK-15细胞中pA3F具有抑制PERV的复制作用，且这种抑制作用在稳定表达pA3F的PK15细胞中也得到了进一步证实。其次通过免疫共沉淀、WesternBlot、酵母双杂交证实pA3F与PERV-Gag蛋白能够形成复合物，激光共聚焦扫描显微镜观察也证实了两种蛋白在PK-15细胞中存在共定位；Western Blot证实在pA3F基因过表达的PK-15细胞培养上清收集的PERV病毒粒子中含有pA3F蛋白。说明pA3F是在PERV-Gag蛋白的协同下被包装进了PERV病毒粒子从而发挥其抑制PERV的作用。与此同时，分析稳定表达pA3F的PK15细胞的PERV基因序列时，发现PERV在pA3F持续表达条件下发生了较多的G→A突变，以上结果提示pA3F很可能由PERV-Gag引导被包装入病毒粒子，最终通过胞苷脱氨作用对PERV产生抑制。这一结果表明pA3F蛋白可以成为降低或消除猪体内PERV的调控靶点，进而使通过pA3F蛋白降低或消除PERV进而培育出无PERV猪种系成为可能。

(四)细胞移植

如前所述，猪到人的异种器官移植还面临着许多悬而未决的难题，因此，临床试验主要集中在异种肝细胞移植和异种胰岛细胞移植等方面。我国关于异种移植的“863”课题也明确提出构建转基因猪肝体外灌注治疗暴发性肝功能衰竭，作为“桥梁”过渡到临床同种肝移植，以及用转基因猪胰岛细胞移植或者对猪胰岛细胞进行基因转染治疗糖尿病。这些可望率先使异种移植走向临床。

1．猪到人异种肝细胞移植  以肝细胞为核心材料的生物人工肝技术已成为当前的研究热点，可为患者提供可靠的过渡性支持治疗。动物肝细胞来源充足，目前正探索使用异种细胞来进行人体的肝细胞移植(HCT)，以解决移植中的肝细胞缺乏问题。在动物模型中，异种肝细胞移植已显示出较好的治疗效果。而临床上将异种肝细胞应用于人体肝病的报道还比较少，移植治疗中的一些关键问题尚待解决。

经过近30年的研究，HCT已成为一种治疗急性、慢性肝功能衰竭和肝脏相关遗传代谢疾病的有效方法。在动物实验中，通过异种肝细胞进行肝细胞移植治疗急性、慢性肝功能衰竭已取得了良好的实验效果。实验研究显示，在肝脏、脾脏和其他一些部位移植成熟肝细胞后，移植细胞能维持其正常光镜和电镜结构，并能继续表达多种肝细胞功能，如白蛋白分泌、糖原存储和酵解、胆红素结合及氨代谢等。通过移植少量的肝细胞在体内增生可以达到以下目的：纠正先天性肝脏代谢缺陷，辅助肝功能支持，替代受损肝实质。国内外文献报道表明异种和同种肝细胞移植对于急性药物性肝衰有相似的疗效。由于人肝细胞移植及生物人工肝需要的肝细胞数量巨大，要求大量、快捷、高效、高质量的分离和获得肝细胞，因此，实验中多选择乳猪作为肝细胞供体。尽管当前在实验研究中关于肝细胞来源、肝细胞培养方法、移植部位选择、移植肝细胞数量及免疫排斥的预防等问题尚未解决，但多数的动物试验都证实了异种肝细胞移植在治疗急性、慢性肝功能衰竭中的良好效应。

当前异种肝细胞移植的主要问题是免疫排斥反应，为降低肝细胞移植的排斥反应，研究者选用的方法有：纯化肝细胞、低温储存、免疫抑制药物、免疫隔离技术等。尤其是免疫隔离技术的发展，在异种肝细胞移植的动物试验及临床应用中取得了令人鼓舞的成果。该技术主要采用一些生物性半透膜，如藻酸多聚赖氨酸膜和中空纤维等，进行肝细胞体外包裹后移植。其作用不仅有保护移植的肝细胞免于排斥反应，而且能增加移植的肝细胞数量和延长肝细胞的生存时间。中空纤维细胞培养技术模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管”即中空纤维给细胞提供物质条件的体外培养系统，在这种培养条件下，细胞可以不断增生和生长，形成类似活体组织的多层细胞培养物。以藻酸多聚赖氨酸制成的微囊是人工合成、球形、超薄、半通透性细胞膜样结构，将肝细胞包裹于此球囊内，其膜上的孔径大小允许营养物质通过，囊内的细胞透过此膜获得营养，而其分泌的生物活性物质也可从微囊排出。此膜不允许具有免疫活性的大分子物质如免疫球蛋白、免疫细胞及其他诸如溶解素类物质通过。因此，微囊能为移植物提供有效地免疫保护，使其免遭受者的排斥反应。刘菲等在急性肝衰大鼠造模后48小时，将猪肝细胞移植于大鼠腹腔内，发现与裸肝细胞移植组相比，经微囊化包裹的猪肝细胞移植大鼠表现出更为显著的治疗效应、存活时间更长，并可降低体液和细胞免疫反应。采用微囊化处理的异种肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰，可予肝功能代谢有效支持，生物半透膜的阻隔作用降低了免疫反应，提高了移植治疗效果。

目前国际上已有多家采用猪肝细胞移植治疗肝功能不全的报道。2002年荷兰阿姆斯特丹大学采用SPF猪分离的肝细胞，形成AMC生物人工肝(AMC-BAL)，治疗一例因HBV感染而致的暴发性肝功能衰竭病人。治疗后病人肝功能和临床指标均明显改善，并成功地过渡到肝移植。意大利Ferrara大学报道了7例病人经过猪肝细胞构成的生物人工肝治疗后，肝性脑病、血氨水平、转氨酶和凝血功能均明显改善。

2．猪到人异种胰岛细胞移植  相对于实体器官移植，胰腺胰岛移植具有较小的移植风险。由于猪与人的胰岛素分子结构相近，仅差1个氨基酸，猪的碳水化合物代谢非常接近于人类，尤其在葡萄糖和其他营养物质所调节的胰岛素分泌方面。临床使用猪胰岛素治疗人糖尿病已有数十年历史，亦证实了其安全而有效，而且猪的来源极为丰富，因此，猪成为临床异种胰岛移植最有希望的动物供体。一般认为，幼猪胰岛细胞免疫原性较弱，故已有一些以此为移植物的临床尝试。成年猪胰岛免疫原性较强，但数量众多，发育成熟，对葡萄糖刺激的应答性好，且来源较胎猪更为丰富，临床使用潜力更大，多用于微囊包裹等异种移植研究。

虽然半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基是实体器官产生超急性排斥反应的主要原因，但仅有不到5％的猪胰岛细胞表达半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基。Hering等将非转基因猪的胰岛移植到短尾猕猴体内，用CD25、CD154单克隆抗体免疫抑制剂治疗，移植物存活超过100天，短尾猕猴体内抗半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基表位抗体并未增加，表明异种胰岛移植的排斥反应主要由T细胞和巨噬细胞介导的细胞免疫，T细胞可以通过直接识别胰岛表面的主要组织相容性复合物(MHC)分子或间接识别抗原提呈细胞(APC)提呈的移植物抗原而介导排斥反应，其中T细胞的间接识别途径是排斥的主要原因。

目前胰岛移植所面临的问题是：①如何有效地分离胰岛；②潜在的细胞排斥反应。现在已经发现从猪的胰腺中获得大量可再生胰岛细胞的方法。利用胶原酶可以溶解去除胰岛细胞以外的非胰岛组织，再在高氧低温环境中去除APC等免疫细胞，获得的胰岛细胞在体内具有增殖分化的能力，并可使糖尿病的小鼠维持正常的血糖；同时由于该方法去除了免疫效应细胞，从而最大限度地抑制了T细胞的直接识别途径，但是对间接途径的抑制作用不明显。因此，对间接免疫识别途径选择性靶点的抑制是今后免疫抑制剂研究的重点。

对抗间接识别现今最好的方法是诱导耐受，对胰腺进行诱导耐受可以通过诱导异种嵌合体产生和应用共刺激分子阻断剂实现，但目前临床尚无法获得持久的异种嵌合体。Cardona等报道将新生猪胰岛移植入狒狒体内，用CD28-CD154共刺激信号通路阻断剂治疗使移植物存活期大于140天；Kumagai-Braesch等将猪胰岛移植给小鼠后，联用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白、抗CD40配体和抗淋巴细胞功能相关抗原-1，移植物功能长期存在且生存期达到5个月。

1980年加拿大学者Lira等利用海藻酸钠多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine alginate，APA)微囊技术包裹大鼠胰岛治疗实验性糖尿病，这项研究标志着微囊化细胞移植技术的确立。国内外研究表明，具有生物相容性的生物膜免疫隔离技术对延长胰岛移植的存活期产生了显著的疗效。Dufrane等用藻酸盐胶囊包裹的猪胰岛移植给灵长类后，在血中抗体存在的条件下，移植物存活期达6个月。章乐虹等采用腹腔镜技术对5例6人次1型糖尿病患者进行了APA微囊新生猪胰岛小网膜腔内异种移植治疗，结果全部病例均未出现手术并发症。术后受体C肽较术前升高3～23倍，胰岛素用量减少，其中1例完全停用胰岛素，成为胰岛素不依赖者长达31个月。

我国已有多家单位开展了猪胰岛异种移植的临床试验。例如，中南大学湘雅三医院在2003年报道了4例肝内移植猪胰岛细胞治疗1型糖尿病的临床报告；广东省中山市人民医院器官移植中心在2006年报道了3例异种胰岛细胞移植治疗1型糖尿病临床观察；白求恩国际和平医院内分泌科2007年报道了异种胰岛细胞移植治疗1型糖尿病2例；中南大学湘雅三医院2011年报道了22例新生猪胰岛移植治疗糖尿病病人的临床研究。这些临床试验主要采用新生猪胰岛，经肝动脉植入。治疗后大部分病人胰岛素用量减少和HbAlc水平降低，改善了血糖的大幅度波动，低血糖发生率降低，所有病人在移植后均未出现严重不良反应，没有PERV感染的证据。但是，仅有1例病人短暂脱离胰岛素治疗7天。这些临床试验表明，幼猪胰岛可以在人体内存活并发挥其功能，短期内无明显副反应。