作为机体提供免疫防护和引发自身免疫疾病的主要细胞，其大多靠分泌有活性的细胞因子来发挥作用，因此除了通过细胞表面的蛋白表达来标记外，检测与活性有关的细胞因子的表达和抗原抗体复合物是一种重要的分析分选方法。

 

免疫细胞表面抗原与荧光标记的抗体特异性结合，形成荧光抗原抗体复合物，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，从而判断免疫细胞的数量和比例。通过长时间的摸索和实践，我们成功建立了流式细胞术检测动物机体免疫功能的方法。目前，本实验室可以进行猴、犬、大鼠、小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞及其他细胞相关抗原检测，建立了成熟的动物免疫分析方案。

 

 

Cytometric Bead Array（CBA），即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的，集ELISA和流式细胞技术优点为一身的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物，然后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。

  

 

CBA应用领域不仅涉及样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析，还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析，药物研发，免疫功能分析等多领域。目前，CBA针对动物也推出了相关检测试剂盒，包括大鼠的IFN- γ、IL-1 α、 IL-4、 IL-6、IL-10、TNF等多种细胞因子。但由于进行CBA实验所涉及试剂较复杂，其对应用软件要求较高。目前，相关免疫学因子实验我们仍主要使用MSD、液相芯片来进行检测，在未来，我们也会不断拓展CBA在动物实验方面的应用。

 

  

流式细胞术也可用于测定细胞周期和细胞凋亡。利用特异性染料对细胞内DNA/RNA进行染色，结合流式细胞术多参数分析，得出DNA含量分布曲线，可以清楚地在一个细胞群中鉴别处于不同细胞周期的细胞的比例。

 

胚胎形成衰老和损伤细胞的清除、自身反应性T淋巴细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡相关。流式细胞术检测细胞凋亡，ANNEXIN V/PI双染是目前最常用的常规方法。为了更好的拓展检测范围，我们也建立了相应ANNEXIN V/PI双染的流式检测基本方案，基本满足了检测要求。

 

 

除此之外，我们还建立了程序性死亡受体PD-1占有率的流式检测方法。是国内为数不多可以检测该指标的实验室之一。

 

 

PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1/PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。PD-L1可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合，抑制CD4和CD8 T淋巴细胞的功能及细胞分子的释放，并诱导淋巴细胞凋亡，从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用，最终导致肿瘤发生免疫逃逸。研究发现，通过阻断T淋巴细胞表面的PD-1蛋白与肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白的结合，从而激发免疫系统清除肿瘤细胞的潜力，可对肿瘤细胞发起有效的攻击。这种治疗方法特异性强、安全性高，在临床上已取得了一定疗效，也是今年来研究的热点。

 

流式细胞术检测受体占有率具体表现为一个比值，这个比值表达为平均荧光强度的差异。用相应药物抗体染色的细胞荧光强度与用同型对照染色的荧光强度之间的差异，比预先与药物接触饱和的细胞的荧光强度。在方法建立的过程中，我们在华西医院资深流式分析专家毛咏秋老师的帮助下，从细胞保存处理到圈定目标细胞群，克服了重重困难，最终成功建立了处理的流程和流式检测方案。目前我们使用外周血单核细胞分离后冻存，然后解冻同时进行分析的方法，进行了约300个样本的受体占有率检测。同时，我们建立了使用动物外周全血检测受体占有率的方法，去除了提取和冻存细胞的过程，这对减少细胞的损耗，优化检测流程都有很大的帮助。

 

 

微核（micronucleus）是真核类生物细胞的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。体外微核实验以微核作为遗传毒性检测终点，可用于染色体断裂剂及非整倍体诱导剂的检测，在化合物遗传毒性评价的体外实验系统中占据重要地位。人工阅片法是传统的检测微核的方法，但其主观性太强，一般要求计数数千个细胞，工作量太大且敏感性较低，并可能导致一些样本的漏检或出现一些假阳性。在动物实验方面，人工法难以满足越来越大的毒理学检验任务要求，发展仪器自动化检测已成为必然趋势。通过与其他实验室共同探索，我们采用-75~-85℃甲醇固定细胞，CD71荧光抗体染色，以疟原虫感染大鼠血细胞为微核模式生物调教流式细胞仪，建立微核流式细胞术检测方法，该方法能明确分辨外周血含与不含微核的网织红细胞和成熟红细胞。流式细胞术作为微核自动化检测方法之一，结果高效、准确、客观，目前已广泛应用于毒理学领域。 

 

 

流式细胞仪的检测范围涵盖细胞结构和细胞功能的多个方面，我们所探索的也不过是冰山一角，作为一门日臻完善的生物检测技术，它已成为细胞学领域中无可替代的重要工具。今后，流式细胞术会向更加自动化、商品化、便携化的趋势发展，这也要求流式细胞仪的使用者和科研人员，不局限于单门科学技术的发展，要不断地有意识地学习各门科学知识和前沿发展技术。在这条不断探索的道路上，我们也会结合工作实际，将流式细胞术应用到更多药理学、毒理学的发展中，为新药安全性评价事业做出自己的努力，与科技共同进步！