摘要：背景：本文的目的是通过评估MMP-9水平，血脑屏障（BBB）通透性及神经功能来探讨罗格列酮（RSG）灌注对微创手术（MIS）造成血肿清除后继发脑损伤的研究。

 

方法：40只兔（2.8-3.4 kg）随机分为正常对照组（NC组；10只）、模型对照组（MC组；10只），微创治疗组（微创组；10只）、结合MIS和罗格列酮组（MIS+罗格列酮组10只）。ICH诱导的所有动物，NC组除外。在MIS和MIS+RSG组，构建ICH模型成功6h后，进行微创手术进行脑出血疏散。MC组动物进行相同的程序进行脑出血疏散，但没有抽吸血肿，NC组进行假手术。在术后第1，3和7天进行神经功能缺损评分（Purdy评分）和确定ICH量。所有动物在术后第7天处死，切除血肿周围脑组织确定PPARγ、MMP-9水平，血脑屏障通透性和脑水含量（BWC）。

 

结果：同NC组比较，MC组的Purdy评分、血肿周围PPARγ水平、血脑屏障通透性，脑水含量均显着增加。MIS 组执行微创手术排除脑出血后，在术后1、3、7天同MC组相比Purdy评分和脑出血量均下降。血肿周围的PPARγ、MMP-9水平，血脑屏障通透性和脑水含量（BWC）明显下降。与MIS组相比，MIS+RSG组显示PPARγ显著增加以及MMP-9，血脑屏障通透性和BWC显著减少。

 

结论：微创手术治疗脑出血后，RSG输液治疗能更有效降低MMP-9及继发性脑损害的水平比MIS治疗。

 

 

背景：原发性脑出血（ICH）占中风的10到20%，在所有中风亚型中死亡率和发病率最高。在神经外科领域自发性脑出血的最佳处理时间仍然是一个具有争议的议题。早期的研究比较开放手术干预与最佳的医疗管理没有表现出明显的效益。最近报告的证据表明，手术是有益的，如果它是在病人恶化之前执行。在出血后6-12 h进行外科手术显示能显著降低MMP-9、血脑屏障通透性和神经功能缺损评分。然而，对幕上脑出血手术管理中的作用仍然存在，虽然去骨瓣减压血肿清除术对治疗高血压性脑出血患者可能是一种有用的手术方法。微创技术疏散血栓似乎是一个很有前途的研究领域，值得进一步调查。目前，微创手术（MIS）对治疗幕上自发性脑出血是一个有益的方法。在临床和实验研究MIS对治疗脑出血已被证明是一种有效和安全的方法。MIS 方法对幕上脑出血患者可能更比其他治疗方案更有效。然而，MIS只能在一定程度上减少血肿引起的脑损伤，并不能完全消除损伤. MIS系统在减少继发性脑损害的作用仍然有限，如红细胞和细胞毒性物质，其渗出液进入脑，是很难彻底清除。因此，MIS去除脑出血后使用药物继续治疗，以防止继发性脑损伤可能是另一个最佳选择。MIS和重组组织型纤溶酶原激活剂对减少血肿周围水肿取得了良好效果。最初ICH总是继发性脑损伤，与一系列相关的炎症因子有关，包括基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶（MMPs）家族的一员。基质金属蛋白酶已被证明在脑出血后血脑屏障中断发挥了重要的作用，在出血性转化过程中，MMP-9参与血脑屏障的失调，这加剧了脑损伤后的脑缺血。MMPs对血肿和脑水肿的发展以及出血性中风的神经元死亡很关键。MMP-9可能参与了脑出血后的继发性损伤，并与血肿周围水肿体积和脑出血的严重程度呈正相关。血肿周围水肿体积与24 h的 MMP-9、MMP-2活性和48 h的MMP-9活性呈正相关。使用药物抗基质金属蛋白酶MMP活性的抑制策略，通过MIS ICH疏散降低MMP-9的释放对降低ICH后水肿持续提供了一个最佳的方法。RSG，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR激动剂γ），已被证明对治疗缺血性中风是有效的。有些研究RSG对脑出血治疗的作用表明RSG促进血肿的分辨率，减少神经元的损伤，提高功能恢复。这些研究结果表明，PPARγ诱发小胶质细胞/巨噬细胞的活化是ICH治疗的有效靶点。在巨噬细胞中，PPARγ可以作为一个重要的因素在促进血肿吸收和保护其他脑细胞免受ICH损伤。然而，关于MIS和RSG结合治疗脑出血的信息还很少。研究表明，罗格列酮干预可下调MMP-9的表达，上调PPARγ表达。

 

方法：试剂: 本研究采用以下试剂：预染蛋白标记物、X光片，SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、四甲基乙二胺，吐温20，牛血清白蛋白（BSA）；4 x蛋白样品缓冲液、β-巯基乙醇，兔对PPARγ多抗，兔对β-肌动蛋白多抗，和兔基质金属蛋白酶9单克隆抗体。

 

主要仪器：ZH蓝星B兔脑立体定位仪、CT、G1315二极管阵列检测器、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、移液装置、引物设计软件。

 

实验组：40只雄性兔子（2.8-3.4公斤）、家兔随机分为正常对照组（NC组；10只）、模型对照组（MC组；10只），微创手术组（微创组；10只）、MIS结合罗格列酮组（MIS+RSG组；10只）。

 

动物准备：脑出血模型：家兔固定于脑立体定位仪上，头骨被钻。使用一个12针和一个1ml注射器，0.5毫升自体动脉血取自耳中央动脉。注射器被连接到一个# 7针其尖端被去除。然后#7针垂直插入并迅速进入颅骨12毫米深，与血缓慢注入基底神经节。3小时后进行CT扫描。基底神经节出现高密度区域表明ICH诱导成功。经CT扫描证实，成功诱导ICH诱导后，兔子被安置在动物室。氨基甲酸乙酯20%静脉注射后，所有动物均在麻醉后5小时内恢复正常。总麻醉时间为3 - 5小时。排除标准包括沿针道回流的可视化，心室中的血与兔子的死亡。

 

微创手术治疗脑出血：兔再次麻醉，注入20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg）到耳静脉。兔子被放置在立体定位仪上，和一个 7针插入血肿。血肿的液体部分是吸气，5000 U尿激酶（溶于0.5 ml 0.9%氯化钠溶液）注入血肿。针在内部保存15分钟，然后缓慢抽吸，同时收回针。在MIS+RSG组、罗格列酮（0.5毫升0.9%氯化钠溶液溶解0.5毫克）在血肿被去除后注入血肿区。在MC组也进行了ICH疏散但没有吸出血肿和无尿激酶注入血肿。兔术后返回动物室。

 

动物的医学治疗：各组动物均接受肌肉注射青霉素（400000 U）以预防感染，并将其置于动物室内直至被处死.。没有其他医疗管理。

 

脑出血体积的评价：1，3和第7天进行CT扫描，以证明ICH疏散手术的效果，MIS之前和之后的脑出血的体积计算公式为：π/ 6×长度（cm）×宽度（厘米）×身高（cm）。

 

神经功能缺损评分：采用神经功能缺损评分法比较各组神经功能。1日，3日和7日由对不了解试验的操作人员测试。

 

脑组织制备：动物模型建立成功后第7天处死动物。大脑被取出并放置在冰上。以针迹为中心，制作冠状切面和矢状切面，在血肿侧切取脑，分为四个部分：前内、前外、后内、后外。从上述各部分，共5mm血肿周围收集脑组织并测定PPARγ水平、MMP-9水平，EB含量和脑水含量（BWC）。

 

过氧化物酶体增殖物激活受体γ和基质金属蛋白酶-9：脑样品缓冲液含有Tris-HCl、NaCl，Triton X-100和双蒸馏水使用匀浆机。在4°C，12000转/分钟将混合物离心15分钟分离上清液。蛋白质定量，样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和转移到PVDF膜。在4°C使用膜封闭液进行阻断培养，第二天使用抗PPARγ（1:100）和MMP-9抗体（1:500）在室温下与二抗孵育（1:100）一小时。

 

血-脑屏障通透性测量：伊万斯蓝（EB）作为示踪剂，测定BBB通透性。每次实验前两小时，2% EB（2ml/kg）注射到耳缘静脉。2小时后，脑组织被迅速移除。对脑出血后血肿周围组织称重（0.1毫克的精度）然后放入含4毫升甲酰胺试管。甲酰胺法测定脑组织中EB含量测定用以下公式测定BBB损伤的严重程度：脑组织EB含量（μg/g湿脑）=B×甲酰胺（ml）/湿重（g）；B是样品的EB含量（μg／ml）的线性回归方程，根据标准曲线.

 

脑水含量测量: 采用干湿重法测定脑组织含水量。迅速取出大脑，收集血肿周围5毫米脑组织。从后内、后外血肿部位脑组织被用来进行测量脑水含量情况。首先，得到的湿组织的重量。将样品放置在烘箱中，在100°C为48小时，和干燥的样品，然后称重。计算的脑组织含水量：BWC=（湿重-干重）/湿重×100%。

 

结果：脑出血模型：家兔在基底节注射血后，表现为对侧偏瘫，不能行走或爬行。另外，对侧肢体对伤害性刺激反应不敏感。大脑基底节CTS呈椭圆形或圆形。表明ICH模型在本研究中是成功和可靠的。直到实验结束，所有的动物都活了下来.。本研究采用四十只兔（每组）10只。

 

脑出血量：成功诱导ICH后，脑出血量无显著差异。MC组血肿量有（0.475±0.022毫升），MIS组（0.478±0.025毫升）和MIS+RGS组（0.480±0.028毫升）。相比，MC组1，3和7天观察到MIS组和MIS?+?RSG组各时间点的脑出血量显著减少，从而表明MIS操作成功地降低脑内血肿。MC组脑出血体积在三个时间点之间差异有统计学意义，提示血肿可自发吸收和吸收。

 

神经功能评分：在成功建立脑出血模型，较正常对照（2±0.233）动物的神经功能缺损评分显著增加（8.834±0.753）表明该模型产生的神经功能缺损。相比MC组，在第3,7天，MIS组和MIS+RSG组，神经功能缺损评分显著下降。MIS+RSG组比MIS组更显著降低评分。

 

伊万斯蓝和脑含水量：相比MC组，MIS组和MIS+RSG组血肿周围EB（F = 495.501，P<0.001）和脑水含量（F = 34.389，P<0.001）显著下降相比。MIS+RSG组显示EB、BWC含量比MIS组降低更显著。

 

结论：脑出血模型建立后PPARγ水平、MMP-9水平，血脑屏障通透性增加，但经过MIS移除血肿组织后，这些测量值，明显下降。其次是MIS操作后辅助使用PPARγ激动剂输液治疗导致PPARγ水平增加和显著降低MMP-9水平及血脑屏障通透性。因此，血肿手术切除后结合药物治疗（通过罗格列酮局部灌注）启动内源性血液吸收机制激活PPARγ是更有效的减少继发性脑损伤，改善神经功能方法。https://link.springer.com/article/10.1186/s12883-015-0287-3