摘要：背景：进行了两阶段实验研究，确定玻璃体腔内注射伊马替尼（IVI）的最大安全剂量及其对大鼠脉络膜新生血管（CNV）的抑制作用。

 

方法：在第一阶段，60只大鼠随机分为六组（A到F）；其中五组接受伊马替尼（IVI）的浓度分别为 330 (A), 250 (B), 165 (C), 80 (D), 和40 (E) ug/5 ul, 对照组（F）接受平衡盐溶液（BSS）。除了视网膜电图（ERG），也进行常规病理分析和胶质纤维酸性蛋白免疫组化。在第二阶段，25只大鼠通过激光光凝诱导CNV，并分为两组。一组玻璃体腔内注射第一阶段摸索的IVI的最大安全剂量，另一组玻璃体腔内接受BSS注射。4周后，比较各组荧光素眼底血管造影荧光素渗漏的平均分和组织切片的平均CNV区数。

 

结果：在第一阶段，ERG和组织病理学检查结果显示视网膜毒性组分别为A至D和A至C；因此，剂量为40 ug / 5uL的伊马替尼被指定为第二阶段的最大安全剂量。在第二阶段，伊马替尼治疗和对照组的眼睛晚期荧光素渗漏和CNV区域之间没有显著差异（分别，P = 0.62和P = 0.5）。

 

结论：虽然有40ug/ 5uL IVI的安全剂量对CNV无抑制作用。需要进一步研究伊马替尼与常规抗CNV药物的可能协同作用。

 

 

背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致65岁以上患者失明的主要原因，也是西方世界最常见的致盲原因。约10%的AMD患者表现为新生血管性疾病。研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）是生理和病理血管生成的最重要的细胞因子，从而导致脉络膜新生血管（CNV）的形成。因此，目前抗VEGF药物是抗血管生成治疗的中流砥柱。

 

血小板衍生生长因子（PDGF）是参与血管生成的第二种重要细胞因子，促进和招募细胞及平滑肌细胞，对血管的成熟和稳定必不可少。PDGF家族结合两种不同的受体，称为PDGF受体α和β。PDGF受体（PDGFR）是酪氨酸激酶受体，内皮细胞和血管平滑肌细胞中能表达更广泛的PDGFR-β。酪氨酸激酶是重要的细胞信号蛋白。多酪氨酸激酶参与血管生成，包括受体酪氨酸激酶，如血管内皮生长因子和PDGF受体。受体酪氨酸激酶对于细胞外信号转导到细胞内是必不可少的。一些受体酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼，西地尼布，舒尼替尼、帕唑帕尼最近被批准，这些药物，通过抑制血管内皮生长因子和PDGF信号，有望成为治疗CNV的新疗法。

 

伊马替尼是一种酪氨酸激酶的特异性抑制剂，在2001被批准用于治疗人类癌症。它能抑制PDGFR信号转导。在PDGFR缺失的情况下，血管周细胞剥离、血管壁的完整性受到损害。这些血管对血管内皮生长因子的提取更加敏感，因此血管的回归更加突出。假设伊马替尼抑制或至少减慢CNV的进展，本研究的设计分为两个阶段。在第一阶段中，在大鼠模型中确定玻璃体内伊马替尼的最大安全剂量，并在第二阶段中，观察玻璃体腔内注射伊马替尼对激光诱导CNV大鼠模型可能的抑制作用。

 

方法：动物： I期的研究的目的是确定玻璃体腔内伊马替尼（IVI）的最大安全剂量和II期其可能的CNV动物模型抑制作用。85只大鼠，体重200-300g。动物被饲养在一个塑料笼内，12 / 12小时黑-光周期下，自由采食和饮水。遵守视觉与眼科研究协会（ARVO）指南。所有操作过程，动物肌肉注射氯胺酮（80mg/kg）和盐酸甲苯噻嗪（5 mg/kg）麻醉。一滴0.5%托吡卡胺扩张瞳孔。最后在I期和II期分别进行ERG和荧光素眼底血管造影后，在深度麻醉情况下，颈椎脱臼处死大鼠。

 

玻璃体腔内伊马替尼注射准备：目前，伊马替尼仅有100和400毫克片剂，并没有任何注射剂。药物的活性物质是甲磺酸伊马替尼，这是一种白色的苯基氨基嘧啶衍生物微黄色结晶粉末耐光。甲磺酸伊马替尼在水溶液中的溶解度取决于pH值，在pH为5.5 - 5.8获得其最高溶解度。用微量硫酸调定无菌蒸馏水pH  5.5 - 5.8。然而，添加伊马替尼粉末后，最终溶液的pH值为中性。将40、80、165，250和330毫克的纯粉放入5毫升容量瓶中，用蒸馏水溶解，然后作量制备40，80，165，250和330 ug / 5uL浓度注射剂。

 

第一阶段：六十只大鼠随机分为六组（A到F）；其中五组右眼注射IVI浓度分别为330（A）、250（B）、165（C）、80（D），和40（E）ug/ 5ul，对照组（F）注射平衡盐溶液（BSS）。注射是在无菌条件下进行，使用手术显微镜操作。对实验前基线，注射后1周和4周进行视网膜电图（ERG）检查。4周后，处死大鼠，其右眼被摘除进行组织病理学分析。在ERG和组织病理学结果的基础上，确定IVI  II期的最大安全剂量。

 

视网膜电图：在伊马替尼注射前、注射后1周和4周，进行视网膜电图。所有程序都在黑暗中进行，红外线照明和图像转换器。ERG操作如前面描述。简而言之，至少2小时的暗适应后，动物麻醉后散瞳。麻醉期间体温维持在36°C和37°C之间。然后将动物置于有温度控制加热垫的记录室中。放置角膜金线电极，记录ERG信号。用RETI-port /扫描21电生理诊断系统记录采集ERG信号。同时进行双眼明视、暗视反应。ERG b波振幅变化低于基线值至少30%认为是明显的。比较各组和组之间ERG在不同时间点的结果。

 

组织病理学和免疫组化检查：ERG记录后，将动物处死，摘除眼球10%福尔马林固定，切片进行光镜检查。每只眼睛轴向分割进行石蜡包埋。5?M组织切片经HE染色后光镜下由两个眼科病理学家观察视网膜各层的完整性和视网膜出血，出现是炎症和萎缩。此外，也进行了神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组化研究。与对照组相比，治疗组视网膜苗Muller细胞GFAP免疫反应性明显增加。组织病理学表明视网膜毒性变化包括：视网膜层的完整性的情况下，视网膜出血的存在，和/或炎症、视网膜神经胶质增生或萎缩的存在和存在显著GFAP免疫反应。

 

第二阶段：25只大鼠右眼诱导实验性CNV。动物随机分为治疗组（14只）接受第一阶段确定的IVI最大安全剂量和对照组（11只）接受玻璃体腔注射BSS。4周后，动物进行荧光素眼底血管造影（FAG），然后被安乐死。通过组织病理学检查评估CNV区域。

 

激光诱导脉络膜新生血管：我们用色素大鼠作为激光诱导的CNV模型，因为大鼠视网膜同人类视网膜非常相似，均匀着色，光凝后表现出较高的CNV。大鼠麻醉后，扩张他们的瞳孔。通过使用裂隙灯红外二极管激光传输系统和非接触式78 D透镜，在每个眼睛的主要血管之间施加六个激光点。每一个激光点的蒸汽气泡的发展指向为Bruch膜破裂。

 

荧光素眼底血管造影：激光光凝四周后，进行荧光素血管造影（FAG），来揭示CNV。在全身麻醉情况下进行血管造影，腹腔注射0.1毫升10%荧光素钠。图片由视网膜专家进行解释，对晚期强荧光血管造影存在病变分级为：0，无泄漏；1，轻微的泄漏；2，中度泄漏；3、突出的泄漏。对任何大鼠的病变的泄漏分数进行了总结，产生一个单一的值，每只大鼠分数为三个观察员的平均分数。

 

组织切片中脉络膜新生血管面积的测量：福尔马林固定眼睛，如上所述，轴向一分为二进行组织病理学处理。石蜡包埋后，连续切片，苏木精-伊红染色，尝试连续切片整个CNV病变。光镜下进行切片检查。选择最大的CNV的部分并使用数码相机拍摄。图像转移到计算机和使用ImageJ软件计算CNV面积。

 

结果：第一阶段：A、C、F组各一只，D组2只，E组3只动物没有存活，被实验排除。

 

视网膜电图：表一显示注射IVI前、注射1周和4周后各研究组明视、暗视的ERG平均振幅。各组ERG图形几乎相同。组与组之间，每组在指定的时间点观察的ERG明视结果无显著差异。然而，注射IVI 4周后A组到D组暗视ERG的b波平均振幅明显减少。E和F组没有明显变化。

 

光镜观察：组织病理学分析显示，视网膜坏死的改变是视网膜层完整性丧失和视网膜萎缩改变的结果。D组和E组的病理组织学特征、GFAP免疫反应同对照组相比无显著差异，考虑ERG及病理结果，40ug/ 5uLIVI为II期的最大安全剂量。

 

第二阶段：25只大鼠中治疗组有3只对照组有1只大鼠被淘汰。

 

荧光素眼底血管造影脉络膜新生血管评分：激光应用四周后，FAG显示激光烧伤部位CNV的发展。伊马替尼注射眼同对照组相比，CNV平均得分没有显着差异。

 

组织切片中脉络膜新生血管区：IVI治疗组与对照组大鼠脉络膜新生血管生长较正常均无显著性差异。

 

结论：玻璃体腔内伊马替尼最大安全剂量为40ug/ 5uL，在这项研究中，对模型大鼠CNV无抑制作用。然而，伊马替尼可能同常规抗VEGF治疗CNV药物有协同作用，这需要进一步调查。