摘要：背景：关节软骨损伤的金标准治疗尚未发现，迫切需要一个符合成本效益和可预测的大型动物模型，以弥补在体外研究和临床研究之间的差距。动物模型应允许临床相关治疗的测试，生物反应应具有可重复性和可比性。需要一个有可靠翻译结果的临床研究。本研究旨在测试现有的临床软骨修复技术，并评估使用每膝盖两个缺陷验证小型猪作为关节软骨修复的临床前模型。

 

方法：使用16头完全成熟的小型猪进行试验。小型猪行双侧滑车软骨钻孔缺损或软骨缺损（6毫米），每膝一个缺陷或每膝两个缺陷。对缺陷进行下列处理：基质诱导的自体软骨细胞移植（MACI），微创（mfx）， 自体组织移植（ADTT），自体骨移植、自体软骨片。空的软骨和骨软骨缺损作为对照。MRI和CT分别进行3个月和6个月，术后6个月进行组织学检查。

 

结果：修复组织形态多样。在6个月通过磁共振成像（MRI），CT和组织学可观察到从非软骨纤维组织到纤维组织的形态学变化。最坏的结果是空的控制，而最好的结果是用MACI和ADTT处理实现。每个膝盖的两个缺陷对修复响应没有任何显著影响。

 

结论：应用治疗的结果与临床研究的结果是一致的，且适用于每膝盖两个缺陷。小型猪模型操作简便，性价比高，提供可预测的结果。基于这项研究，每膝关节两种缺损的，一个在内侧和一个在外侧滑车面，推荐使用雄性小型猪模型。

 

 

背景：关节软骨不能自行愈合，到目前为止还没有一种治疗方法能够以一致的和可预测的方式再生透明软骨。几个公认的软骨修复方法可包括微创（MFX）和基质诱导的自体软骨细胞移植（MACI）。MFX带来短期的临床改善，但由于纤维软骨和纤维修复组织的性质，2-5年后改进趋于恶化。MACI有相似的临床改善结果，但比MFx更持久。但MACI治疗有限制因素，需要两个独立的外科手术和细胞培养的成本较高。最近，软骨芯片的使用正在成为一种潜在的治疗方法。已发表的研究关注于少年软骨和自体软骨芯片结合支架或嵌入在纤维蛋白胶中，但长期结果悬而未决。为开发新的手术治疗方法和测试现有的方法，成本效益可靠，可预测的大型动物模型是必要的。小型猪以前被用于软骨修复研究。在18个月时骨骼达到成熟，以股骨远端生长板的闭合和软骨的成熟为特征。直径为5毫米的缺陷已被证明是临界尺寸。骨骼成熟度是重要的，以防止由于内源性愈合高估其修复反应。动物的大小，关节的尺寸使小型猪成为研究软骨的一个有吸引力的动物模型。组织学评价动物模型的愈合反应，成像应与人类的相媲美来实现一个可靠的翻译结果。此外，使用多软骨缺损的动物是重要的，无论是经济上和伦理上，因为利用多个缺陷，将允许研究人员减少使用的动物数量。一个关节多个损伤的修复效果还没有被研究。本研究旨在验证：1) 验证小型猪作为临床前模型利用现有的临床修复技术进行软骨和骨软骨的修复，2）同单膝缺损修复效果相比，研究两膝缺损（双缺损膝）是否会影响修复效果。

 

方法：实验设计如图。对两个独立的研究假设进行了测试。所有动物均接受双侧膝关节手术。第一项研究每膝一个缺损。用十头小型猪（5雄，5雌）。每膝盖一个缺陷使用五种不同的治疗方法和两个不同的空白对照对其适用性和修复反应进行测试。第二项研究每个膝盖两个缺陷，6头雄性小型猪接受每个膝盖两个缺损。比较了邻近缺损、单膝缺损和双膝缺损的疗效。小型猪的平均年龄为21个月（18.5-23.7个月）。平均体重为41.9公斤（32.4 - 47公斤）。

 

麻醉：使用阿扎派隆（0.1ml/Kg）和速眠安（0.1ml/Kg）皮下给药诱导麻醉镇静。通过耳静脉给予依托咪酯（0.25ml/Kg）进行全麻.插入气管导管，规格6.5。使用七氟烷（3%）和芬太尼（0.175ml/kg/h）维持全身麻醉。术前，给予预防性抗生素治疗动物（盘尼西林0.03ml/kg）。

 

手术：局部镇痛药分别作用于皮肤和关节周围组织（赛罗卡因，10ml，20mg/ml）。远端髌骨极和胫骨粗隆被标记，在髌韧带直接做一个5厘米中线皮肤切口。暴露出髌韧带，获得从远端髌骨极到胫骨粗隆的髌骨韧带切口。通过这个切口暴露出髁间窝和滑车。

膝关节单个损伤，在滑车槽的内侧面小型猪接受软骨或骨软骨缺损约2cm，靠近股骨髁间窝。膝关节软骨双缺损，一是在滑车槽内侧面，约两厘米的髁间窝近端，而其他骨软骨缺损在滑车槽外侧面，约1厘米的近端内侧缺损。软骨缺损概述使用6-mm皮肤活检冲头和用刮匙将软骨小心地剥去，直到所有软骨包括钙化软骨层被移除，没有发现任何软骨下出血。使用一个空心的6毫米钻头创建骨软骨缺损直径6毫米和深度为8毫米。为了避免对组织的热损伤，进行了低速手动钻孔。如表治疗后进行髌骨韧带、皮下组织和皮肤缝合。术后对动物使用氟尼辛葡甲胺1.1mg/kg，口服进行镇痛消炎，连续服用5天。单缺损膝关节缺损随机分为七组，见表1。双缺陷膝随机分为自体骨移植（ABG）或自体双组织移植（ADTT）。

 

磁共振成像（MRI）：评价修复组织表面，软骨下骨组织和修复组织的信号强度，每只小型猪术前进行MRI扫描，术后三和六个月使用3 T全身磁共振扫描仪扫描。使用下列序列：双回波稳态（DESS，三维成像视场（FOV）151×180×90毫米；采集矩阵216×256×TR128；TR 13.5；TE 5.0；翻转角度28°；采集时间5分25秒），空间（三维成像视场98×180×78毫米；采集矩阵140×256×TR 112；TR 1000；TE 40.0；ETL 52；采集时间3分57秒）和MPRAGE（三维成像视场120×183×99.8毫米；采集矩阵168×256×TR 128；TR  2200；TE  2.65  TI  900；采集时间3分49秒）。所有的3D成像序列采用0.7×0.7×0.7毫米的各向同性体素法。

 

计算机断层扫描（CT）：评估骨软骨损伤的骨修复，修复组织结构和软骨下骨囊肿的存在，术后3和6个月对每只动物进行CT扫描。由于其临床意义选择使用一个微型CT。为了达到最佳的各向同性分辨率0.6×0.6×0.6毫米，在技术上应用以下扫描参数：120 kV，200 mAs，层厚0.6 mm，螺距因子0.5毫米和307毫米的视野，0.3毫米的过滤器或b40f或b80f增量。为确定骨缺损量、感兴趣区域（ROI）对应于骨缺损上绘制到一个2D幻灯片上，并使用OsiriX ROI体积工具计算骨缺损体积。通过比较剩余缺损体积与原始钻孔缺陷，计算骨缺损修复率。

 

组织学：术后6个月处死动物，并拍摄缺损的大体外观。样品在4°C的递增乙醇浓度中（70 - 96%）脱水。4°C，.在2 -异丙醇、二甲苯清除之前与甲基丙烯酸甲酯（MMA）浸润。在?20°C，. MMA加速N`N-二甲基对甲基苯胺的聚合反应。用切片机将缺损部位样品切成10μm连续切片。样品用苏木精和伊红（HE）、甲苯胺蓝、番红染色。在第一项研究中，根据细胞形态，糖胺聚糖（GAG）染色和修复组织表面，评价每个治疗组的样本大小。在第二项研究中，由两位有经验的工作人员对修复反应使用ICRSⅡ评分系统进行盲法评价。

 

动物福利：受过训练的动物饲养员在兽医的监督下，每天仔细观察每只动物三次。如果动物饲养员认为小型猪出现跛行或不适，根据一般外观、食欲、临床表现（体温、粪便评估）和行为，对动物进行进一步评估，无论是单独和与动物饲养员互动时，每个类别都被评分为1 - 4。术后第四天，轻度跛行、食欲和活动程度下降被接受。

 

结果：最初五天经镇痛治疗后，没有动物跛行，食欲下降，也没有降低活动水平。经髌韧带的手术方法提供了充分接触内侧和外侧滑车面的机会。内侧和外侧滑车面很适合6毫米的缺损。

 

第一项研究：任何治疗组均未发现透明软骨完全再生。软骨治疗组均顺利，但修复组织表面凹陷，极少量GAG阳性染色。最坏的结果是发现空缺陷（图3a），主要是纤维组织，而最好的结果是在一个透明组织和纤维软骨混合的MACI组。术后三个月和六个月的缺损在缺损中有明显的差异，在MACI组非透明组织光滑、表面稍凹陷。在骨软骨治疗组最坏的结果也发现空缺陷，其中纤维组织占主导地位。最好的骨软骨的修复结果出现在ADTT组，主要的发现是透明组织和纤维软骨占主导。MRI显示空洞缺损有明显的表面凹陷，而ADTT组缺损组织充盈类似健康软骨。CT成像显示骨体积从3个月到6个月明显增加表示连续的软骨下骨再生。软骨下骨体积从3个月增加到6个月，平均为36%，与天然软骨下骨的水平相比，6个月后平均骨缺损只有0.06厘米（SD±0.04）。

 

第二项研究：ADTT和ABG治疗组膝盖没有显著差异。ICRS II评分在相邻缺损之间没有显著差异。

 

结论：基于本研究结果，作者建议小型猪作为一种适合软骨修复动物模型。六个月随访的临床相关的治疗方法，组织学与人类发现类似。CT成像对证明软骨下骨修复的监测至关重要，并建议用于所有骨软骨治疗的评价。雄性小型猪膝关节双缺损被证明是最有成本效益的方法。

https://link.springer.com/article/10.1186/s40634-015-0031-3