摘要：啮齿类动物模型被广泛应用于抗抑郁作用的研究。然而，药理模型并不总能考虑到疾病过程的复杂性。在本文中，我们证明了重复低剂量利血平急性给药（0.2mg/kg  ip）能产生抑郁症药理动物模型。这是基于对囊泡单胺转运体2的抑制作用，减少弱大脑单胺类神经递质功能。事实上，我们观察到，低剂量利血平对强迫游泳试验（FST）有明显的抑郁样行为，而且大脑结构中多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺的水平显著降低。1，2，3，4 -四氢异喹啉（TIQ）和近甲基衍生物，1 -甲基- 1 -四氢异喹啉（1MeTIQ）是哺乳动物的大脑自然存在的外源性和内源性胺。对强迫游泳实验和利血平诱导的抑郁动物模型有显著的抗抑郁作用。通过不动时间和游泳时间评估TIQ和1MeTIQ（剂量25mg/kg）联合给药拮抗利血平产生的抑郁。生化数据与行为实验一致，表明低剂量利血平与急性给药相比具有长期疗效，引起脑内单胺类神经递质的重要结构抑制和受损的代谢。对TIQ和1MeTIQ负责其抗抑郁作用作用可能的分子机制进行了探讨。在行为学和生化研究的基础上，我们认为这两种化合物可能是治疗抑郁症的有效药物。外周给药时容易穿透血脑屏障，内源性物质不可能有副作用。

 

 

背景：中枢神经系统单胺类神经递质如多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺（5-HT）在抑郁症的病理生理过程中起关键作用。然而，单胺能神经传递的异常与许多神经系统疾病包括帕金森病（PD）与精神分裂症有关。虽然引起抑郁症的机制还没有被明确阐明，然而，与活性氧（ROS）产生相关的氧化应激可能是导致这种疾病的分子过程的主要原因之一。单胺类神经递质在胞液代谢和自动氧化的单胺类神经递质生成内源性ROS。生理上，神经元有许多内源性机制来维持健康和防止退化。囊泡单胺转运体2（VMAT2）有调节神经元的胞内环境功能，保护其免受内源性和外源性毒素侵害。单胺类神经递质DA和NA，特别要在细胞质中的自发氧化的能力，对细胞结构有潜在破坏性。VMAT2的表达水平对神经细胞安全有重要作用，是氧化细胞敏感性的本质。利血平是一种囊泡单胺再摄取阻滞剂，阻滞脑内单胺神经递质，并产生抑郁综合征动物。本研究中，从四氢异喹啉组我们分析了内源性物质的抗抑郁药的潜力：1,2,3,4-四氢喹唑啉（FIQ）及其近的甲基衍生物，1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉。这两种化合物都是TIQ家族的成员，广泛存在于植物，动物和人类大脑。这两种化合物都容易通过血脑屏障进入大脑，并且它们的神经保护特性可能与临床观点有关。此外，这些化合物尚未在利血平抑郁模型中抗抑郁药物的作用下进行研究。在本文中，我们研究了低剂量利血平急性重复治疗的行为学和神经化学效应，然后评估TIQ和1MeTIQ对利血平诱导的大鼠抑郁症模型的抗抑郁功效。使用行为强迫游泳试验（FST）检测TIQ和1MeTIQ的抗抑郁性能。FST是一种对抑郁症患者的抗抑郁功效有很高的预测效度的试验。一种行为取样技术被开发出来，它包括了不动、游泳和攀爬等个体反应类别。尽管所有抗抑郁药物都能减少FST中的固定时间，但至少有两种截然不同的活性行为模式是由药理学选择性抗抑郁药物产生的。羟色胺选择性再摄取抑制剂能增加游泳行为，而主要作用于提高细胞外钠或DA水平的药物会增加攀爬行为。此外，自发活动试验是用来检查利血平化大鼠运动功能。除了行为测试外，在研究的第二部分，检测大鼠脑组织结构[腹侧被盖区（VTA）、伏隔核、下丘脑] 神经化学物质来确定：单胺类递质及其代谢产物的水平，单胺代谢率和神经活动的指标。

 

动物：对体重230～240克（约7周龄）的雄性Wistar大鼠（Charles River）进行行为学测试。这些动物在标准实验室条件下，可自由采食和饮水，室温22℃，人工昼夜循环（12/12小时，上午7点照明）。

 

药物：TIQ和1MeTIQ溶于无菌0.9%氯化钠溶液。利血平悬浮于1%吐温80。药物注射量为4ml/kg。

 

给药：为了检验利血平的促抑郁作用，本实验方案分为两个主要部分。在研究的第一部分（利血平抑郁模型），我们分析了利血平单次（0.2毫克/公斤的ip）和重复给药（每日一次，14天）后引起的抑郁症的各种行为（强迫游泳实验、自主活动：行驶距离和饲养时间），生化试验（单胺类神经递质的浓度：脑结构中的DA、NA和5-羟色胺）。为了评价利血平效应的持续时间，在最后一次注射后120分钟进行了测试。

在该研究的第二部分，我们评估了TIQS的抗抑郁效应。在利血平（0.2毫克/公斤的ip）注射前30min给予TIQ和1MeTIQ（25mg/kg ip）连续给药14天。在最后一次利血平给药120分钟后进行行为和生化试验调查对利血平诱导的抑郁障碍的影响。对照组长期服用1%吐温80。行为测试结束后，断头法处死大鼠，解剖不同的大脑结构（VTA；伏隔核和下丘脑），研究神经化学，高压相色谱法（HPLC）及电化学检测（ED）评估单胺类神经递质的代谢。实验在上午10点到下午4点之间进行，每个实验组由6-8只老鼠组成。

 

行为研究：FST：所有的动物都单独在FST中连续两天进行测试，每天一次。第一天，将大鼠分别放入非透明塑料缸（直径：23厘米，高度：50厘米），含30厘米的水，保持在25 - 26°C。它们被允许游泳15分钟后才被移出。之后，这些动物被风干并回到它们的笼子里。24小时后重复这个过程，记录逃避型大鼠的行为时间（测试5分钟）。所观察到的行为参数（按优先级顺序）是：漂浮在水中的时间（不动）、游泳和挣扎（攀爬）。当它只做必须保持头部在水面上的动作时，这种不动性被描述为老鼠的行为。在这种情况下，动物可以做一些轻微的游动来保持漂浮。攀登被定义为四肢的有力运动，在游泳过程中，大鼠用四肢进行协调和持续的运动。通常围绕在缸的内部，没有前肢露出水面。不同动物更换水。急性和慢性（14天）注射利血平（0.2毫克/公斤的ip）及利血平给药前30min给予TIQ和1MeTIQ（25mg/kg ip）联合给药最后一次操作后120 min进行FST 。

 

自发活动：通过连接IBM-PC测量动物的自发活动。每笼（43 x 44 x 25 cm）周围是15×15阵列的光电管梁距地面3厘米。这些光电池光束的中断被计算为水平和垂直运动，水平的自发活动被定义为横向行走（cm），垂直活动作为纵向爬高（以秒为单位）。使用自动跟踪软件程序分析活动， 15分钟间隔内记录一次记录60分钟。测定利血平急性和慢性给药后120 min的自发活动（14天）（0.2毫克/公斤的ip）。

 

神经化学的研究：体外实验：大鼠脑组织单胺代谢：动物行为学实验结束后断头处死。大脑在一块冰冷的玻璃板上迅速地被摘取和解剖。断头后，VTA、伏隔核和下丘脑被立即冷冻在固体二氧化碳（?70°C）中直到用于生化分析。用高效液相色谱法（HPLC）和电化学检测（ED）钠及其主要的非神经系统脑代谢物NM和5-羟色胺（5-HT）及其代谢产物5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、DA及其代谢产物，突触，3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）等。组织样本称重，用冰冷的0.1M含0.05 mM抗坏血酸的三氯乙酸匀浆。离心后（10000g，5 min），上清液通过RC58  0.2μm纤维素膜过滤. 惠普1050was色谱仪配备Hypersil BDS-C18柱（4×100毫米，3μm）。流动相包括0.05米柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH值3.5；0.1mM EDTA；1 mM辛基磺酸钠和3.5%甲醇。流速保持在1毫升/分钟。DA、5-羟色胺、钠及其代谢产物通过峰面积比较与分析当天运行的标准进行定量。

 

结果：行为研究：急性和慢性给药利血平对最后一次注射后120分钟的FST：慢性给药，而不是急性注射利血平（0.2毫克/公斤的ip）产生亲抑郁活性显著增加大鼠FST不动时间。一维方差分析显示，慢性利血平给药后游泳活动量明显下降（约25%），且攀爬活动无明显变化。

 

自发活动试验：探索大鼠的自主活动运动活动测量开始后第一个30min，低剂量的利血平急性和慢性给药（0.2毫克/公斤的ip）产生显著横向行走和纵向爬高运动降低。在45和60分钟后，利血平组和对照组的运动活动无明显变化。

 

TIQ和1MeTIQ慢性给药对利血平诱导的大鼠抑郁样行为的影响FST测试：TIQ和1MeTIQ慢性给药（14天）剂量为25毫克/公斤,IP可完全拮抗利血平诱导的抑郁活动。一维方差分析显示治疗效果显著，利血平单独给药后能导致大鼠不动时间增加，但是TIQ和1MeTIQ联合给药后，显著降低不动时间。TIQ和1MeTIQ联合给药后，相比利血平单独给药，游泳时间显著减少。TIQ和1MeTIQ联合给药后，攀爬时间显著增加。

 

 

单次和重复低剂量的利血平对单胺类神经递质（DA、NA 、5-羟色胺）的浓度影响的比较：一维方差分析显示重复利血平给药对DA和NA水平有显著影响。重复利血平与单次注射相比，重复给药显著降低了DA和NA的水平。

 

TIQ 和1MeTIQ重复给药对利血平诱导的抑郁行为影响-DA系统：多巴胺：一维方差分析表明，TIQ 和1MeTIQ重复给药对VTA，伏隔核和下丘脑的DA浓度有显著影响。慢性利血平重复给药后的DA浓度显着减少。TIQ和1MeTIQ完全拮抗利血平诱导的DA浓度降低，联合治疗组DA水平恢复到控制值。

 

TIQ 和1MeTIQ重复给药对利血平诱导的抑郁行为影响-NA系统：NA：一维方差分析表明，TIQ 和1MeTIQ重复给药对VTA，伏隔核和下丘脑的DA浓度有显著影响。慢性利血平重复给药后的NA浓度显着减少。TIQ和1MeTIQ完全拮抗利血平诱导的NA浓度降低。

 

TIQ 和1MeTIQ重复给药对利血平诱导的抑郁行为影响- 5-羟色胺：一维方差分析表明，TIQ 和1MeTIQ重复给药对下丘脑的5-羟色胺浓度有显著影响。重复利血平给药导致VTA和下丘脑的5-羟色胺浓度明显降低。TIQ和1MeTIQ完全拮抗利血平诱导的5-羟色胺浓度降低。