摘要：确定是否保持排空心脏跳动是维持猪肥大心脏瓣膜手术的一种有效替代方法，并探讨其可能的作用机制。

 

方法：十头巴马小型猪心脏肥大的病例随机分为2组（n = 5组）。一组常温灌注正常血钾（NNSP）。另一组常温灌注高血钾型（NHSP）作为对照组。磁共振成像评价心脏收缩功能、心肌能量代谢和心肌灌注。免疫印迹法测定肌钙蛋白I（cTnI）、肌钙蛋白T（cTnT），casapase SM MHC - 3，和PARP4的表达。TUNEL法检测心肌细胞的凋亡。

 

结果：同心脏骤停使用NHSP相比，NNSP保持空的心脏跳动并改善其收缩功能。在维持心肌能量代谢的方面， NNSP和 NHSP无显著差异。在NHSP组的一个心脏里发现13%灌注缺损区，而在两组的其他心脏里没有发现该现象。Western印迹法测定发现：相比于NNSP组，NHSP组的cTnI、cTnT 、casapase-3和PARP4的表达大量增加。相反，在NHSP组SM-MHC表达与NNSP组相比降低。在NHSP组每平方厘米TUNEL阳性细胞核数目与NNSP组相比显著增加。

 

结论：使用NNSP保持心脏跳动是肥大心脏瓣膜手术的一个替代技术。

 

背景：迄今为止心脏外科手术是治疗瓣膜疾病最有效的方法。对于安全有效的瓣膜手术而言，心肌被充分的保护被认为是一个重要方面。应用低温停搏液技术，在初始阶段通过降低氧消耗诱导心肌保护作用。然而，后来观察到，停搏技术可能会导致随后的心脏损害，特别是再灌注损伤，特别是患者的心脏功能严重受损，如心肌肥大、低射血分数、冠状动脉血管形成等。

 

心肌肥厚伴随着血管周围和间质结缔组织的发育，直接影响心脏的收缩和舒张。心肌间质显著增大、毛细血管和线粒体密度降低。这些病理改变为心肌灌注和能量代谢的严重损害提供了组织学基础。停搏液作为心肌保护方法时，停搏液可消除心肌收缩对冠状动脉系统的挤压作用，对维持正常心肌细胞稳态和血流灌注有重要作用。此外，停搏可导致钾和氯化物的增加，这可能会导致细胞外和细胞内的水积累。因此，结合心肌肥厚和心脏停搏液副作用的病理变化，停搏技术不可能为肥大心脏的高危患者提供最佳保护。

 

由于冠状动脉旁路移植术（CABG）的发展，心脏停搏不再被认为是心脏手术不可缺少的组成部分。瓣膜手术也可以在跳动的条件下进行。在心脏停搏前发展的早期心脏停搏心脏瓣膜手术，是唯一可行的心肌保护方法。发表的初步临床经验表明，在瓣膜手术期间保持心脏的排空和跳动，有利于高风险患者。据推测，保持心脏的排空和跳动同缓解心肌细胞凋亡密切相关。此外，还推测，保持心脏排空和跳动，可以改善心肌血流量，收缩功能和能量代谢。这个实验的目的是验证投机是否能得到满足。

 

方法：压力超负荷左心室肥厚猪模型：8 - 10周龄巴马小型猪，体重为10-15公斤，镇静与肌肉注射地西泮（0.4毫克/公斤）和氯胺酮（20毫克/公斤）。一旦仔猪被麻醉，插管和机械通气。静脉注射3%戊巴比妥钠维持全身麻醉。在第三肋间进行左外侧开胸术。切开心包，注意避免膈神经损伤。在硅胶管内放置一条缝线，以绕开升主动脉环。缝合的两端绑在一起，在左心室（LV）和主动脉远端到狭窄允许管重叠创建收缩压峰值梯度为10至20 mm Hg。手术结束后关闭胸腔，恢复期12周来发展左心室肥大。

 

心肌肥厚保护模型：主动脉结扎术后十二周，全麻下胸腔再次开放。心包沿中线纵向打开。动物肝素化（3000 IU肝素注入外周静脉），解剖和夹紧主动脉，肺动脉，上腔与下腔静脉。升主动脉建立常规体外循环，维持全身常温（36.5- 37°C）单右心房插管，灌注流量250毫升/分钟， 80-120毫米汞柱逆行灌注压。经右心房切口下将吸引器放置到冠状静脉窦附近。将循环后的液体回收。

 

从胸腔收集猪血，同Krebs－Henseleit液体按照1:1混合，用作灌注液。Krebs- Henseleit液体作为一种生理灌注介质被广为接受，并被使用多年。Krebs- Henseleit溶液含有118 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，11 mmol/L葡萄糖25 mmol/L NaHCO3，1.75 mmol/L的氯化钙和0.625%牛血清白蛋白。钾浓度为4 mmol/L和16 mmol/L分别为常温正常血钾型同时灌注（NNSP）和常温高血钾型同时灌注（NHSP）。整个手术过程中心脏温度保持在36.5°C到37°C。

 

实验方案：十只心脏肥大的猪模型被分为两组，每组五只。第1组（n = 5）被用来评估排空心脏搏动的影响（NNSP）。第2组（n=5）被用来评估心脏骤停的效果（NHSP）。两组都接受80 min操作。80因为它能满足大多数瓣膜手术时间。间歇式输送被用于本研究常温心脏停搏。80分钟操作期后，两组的主动脉交叉钳被移除。正常灌注和猪的核心温度保持在35 - 37°C。手术后立即使用MRI评估心脏收缩功能和左室壁厚度。总时间间隔小于20分钟。使用P 31磁共振波谱监测心肌能量代谢。磁共振灌注成像评价心肌灌注。所有MRI图像由Philips Achieva 3 T超导磁共振扫描仪采集。

 

影像学检查后，处死动物，解剖和获取心肌标本。测量心脏和左心室重量（LV游离壁和隔膜）。正常猪心脏的相应数据，作为本研究的控制，被称为另一项研究，我们尚未公布。LV（冠状动脉）组织进行实验室实验。免疫印迹分析测定肌钙蛋白I（cTnI）的表达，cTnT、平滑肌肌球蛋白重链（SM-MHC），casapase-3和PARP4。TUNEL法检测凋亡的心肌细胞。

 

收缩功能评估：用磁共振成像测量左心室收缩末期容积和左心室舒张末期容积。肥大心脏的收缩能力也由左心室射血分数来评估。

MR灌注成像：磁共振灌注成像评价肥厚心肌组织血流灌注。使用回波平面成像序列（EPI）监测MR灌注成像信号强度。两组猪注射Gd-DTPA增强扫描（0.05毫摩尔/公斤）。注入造影剂10分钟后，采用相位敏感反转恢复序列（PSIR）延迟强化。

 

Western blot：将新鲜冷冻心肌组织样品加入缓冲液匀浆。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离提取心肌组织中的蛋白质。蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上，用cTnI、cTnT，SM-MHC初级抗体，PARP4和casapase-3的一抗阻断。在初级抗体孵育后，将膜在适当的二抗中孵育。冲洗后，用电化学发光试剂检测抗体结合物。

 

TUNEL法检测细胞凋亡及定量：细胞凋亡的检测采用末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）进行原位末端标记（TUNEL）法。大约随机选择20个非重叠的图像覆盖区和边境地区。观察员计数每个图像的TUNEL阳性细胞核的数量。结果表示为每平方毫米面积的TUNEL阳性核数。

 

结果：心肌肥厚：肥大心脏组的LV与整个心脏的重量比明显高于正常心脏。肥大心脏组的LV厚度（2.02±0.17 cm）明显高于正常心脏（1.24±0.05 cm）。12周主动脉带紧束导致显著的LV肥大。

 

NNSP 和NHSP对收缩功能的影响：经历NNSP 和NHSP后，左室收缩末容积、左室舒张末期容积均由磁共振成像测定。肥大的心脏收缩能力是由左心室射血分数评估。NHSP组左心室射血分数（58.43±5.615%）均低于NNSP（75.33±2.675%）。

 

NNSP和NHSP维持心肌能量代谢的作用：从NHSP和 NNSP组心脏获得P31磁共振光谱显示见图2A。心肌PCR，PI和平均ATP的水平见图2B。无论是哪种灌注技术心肌ATP，PCR和PI的水平没有显著的变化。

 

NHSP 和NNSP对肥厚心肌组织血流灌注的影响：MR灌注成像是用来评估NNSP和NHSP对肥厚心肌组织的血液灌注作用。灌注扫描的目的是通过磁共振灌注成像识别缺血区，即灌注缺损区。在NNSP组没有发现缺血区。在NHSP组的一头猪发现有13%灌注缺损区。

 

NHSP和 NNSP对心肌纤维蛋白水解和血管损伤程度的影响：为了探索NNSP和NHSP对心肌纤维蛋白水解和血管损伤的程度，免疫印迹分析测定血清cTnI 、cTnT和SM-MHC的表达。NHSP组cTnI和cTnT的表达水平均显著高于NNSP组。相反，在NHSP组SM-MHC表达与NNSP组相比明显减少。

 

NNSP和NHSP对caspase-3和PARP4蛋白表达的影响: 探讨NNSP和NHSP心脏损害后，Western blot法检测凋亡调节蛋白PARP4和casapase-3水平。在NHSP组caspase-3的表达同NNSP组相比大量增加。此外，PARP4也被认为在细胞凋亡级联的调解中发挥了举足轻重的作用。结果显示一个NHSP组心脏组织PARP4表达水平同NNSP组比较显著升高。

 

NHSP和NNSP对细胞凋亡的影响：TUNEL法检测细胞凋亡并进行定量分析。在NHSP组每平方厘米TUNEL阳性细胞核数目与NNSP组相比显著增加。

 

结论：相比于使用NHSP心脏骤停，NNSP保持心脏跳动对肥大的心脏有保护作用。需要进一步调查NNSP，以确定其保持心脏排空和跳动对心肌灌注的影响。NNSP法保持心脏跳动是肥大心脏瓣膜手术过程的一个替代技术。