摘要：虽然膝关节和脚踝之间的骨髓刺激技术结果有差异，但这些差异的详细机制尚未阐明。本研究旨在探讨兔膝关节和踝关节形态的差异是否会影响骨软骨缺损的治疗效果。

 

方法：兔膝关节和踝关节骨软骨缺损。在膝关节，骨软骨缺损发生在股骨内侧髁（MFC）和髌骨沟（PG）。在踝关节，缺损发生在距骨可覆盖或未覆盖区域的胫骨远端。建立骨软骨缺损后，进行钻孔。术后4, 8周和12周，对骨软骨缺损的修复进行组织学评价。分析兔两种关节软骨细胞的增殖和软骨组织蛋白多糖释放对IL-1β的反应。

 

结果：术后8周，距骨和MFC覆盖区缺损处可见透明软骨修复。12周时，距骨覆盖区缺损可见透明软骨，厚度正常。术后12周，距骨覆盖区缺损处软骨下骨形成，CT下软骨下骨形态正常。膝关节和踝关节软骨细胞增殖率和蛋白多糖释放率无显著差异。

 

结论：距骨覆盖区显示膝关节和距骨裸露区域的早期和足够的骨软骨修复。连接一致的关节表现出较好的软骨修复。

 

 

背景：关节软骨的修复能力有限，未经治疗的关节软骨病变可能进展为骨关节炎（OA）。许多治疗关节软骨的策略已经被开发，包括骨髓刺激技术、骨软骨移植和组织工程方法。关节软骨由稀疏的软骨细胞和密集的细胞外基质组成，主要为2型胶原和蛋白多糖。关节软骨缺乏血管和神经支配，使关节软骨修复困难。关节软骨的结构在个体间不同，这可能导致治疗结果和骨关节炎进展不同。有几篇报告证明膝关节和踝关节之间的关节软骨的结构和生化差异。对于关节软骨的修复，骨髓刺激技术已得到广泛应用。在缺损区，通过方法如微骨折或钻井。在缺损区刺激骨髓产生血凝块，结果距骨钻孔后80～96%的病例预后良好。另一方面，股骨内侧髁（MFC）钻孔后的结果69～80%的病例显示了良好的结果。整体而言，距骨的结果优于MFC。

 

影响膝关节和踝部骨髓刺激后结果差异的因素尚未被探索。膝关节和踝关节软骨之间的生化和结构上的差异可能会影响软骨在骨髓刺激后的修复能力。然而，膝关节和踝关节之间的关节形态的差异应该被检查。至于膝关节，股骨髁和胫骨平台不具有良好的一致性，而踝关节具有良好的一致性。关节形态的差异可能影响软骨修复的能力。OA是由软骨损伤引起的，膝关节和踝关节原发性OA的发生率不同。膝关节比踝关节症状性OA影像学标志多发约八至九倍甚至更频繁。软骨损伤引起的骨关节炎可能是由于邻近软骨变性而导致的，而软骨缺损周围软骨中的炎性细胞因子和生物力学应激等分解因子可能影响软骨损伤后的进展。软骨细胞对炎性细胞因子和膝关节和踝关节之间的增殖反应可能有差异，这可能导致膝关节和踝关节软骨损伤后OA进展的差异。了解可能导致软骨修复结果差异的因素以及膝关节和踝关节骨性关节炎的发病率可能改善治疗后的结果。本研究旨在探讨距骨（一致性关节）与膝关节（非一致性关节）钻孔后软骨修复的差异。此外，还观察了膝关节和踝关节对软骨细胞增殖能力、蛋白多糖（髌骨沟）（PG）和软骨对IL-1β反应的影响。结果表明，形态学和生物化学因素在膝关节和踝关节软骨退变中的作用是不同的。

 

方法：手术：18只日本大耳白兔（3-3.5公斤）。家兔静脉注射戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg），1%利多卡因皮下注射。膝盖和脚踝脱毛并用70%酒精消毒。骨软骨缺损在左膝盖的MFC，右膝的PG，双侧距骨创建。对于膝关节，通过内侧髌旁入路，髌骨横向脱臼。在MFC或PG创建骨软骨缺损。MFC的缺陷部位是在部分负重区域的MFC的中心和顶端创建的。在弯曲的膝关节负重区在兔下后方。髌骨沟的骨软骨缺损是在凹槽的中心和髌骨的屈曲位置处产生的。距骨产生两种骨软骨缺损。左侧距骨中心的骨软骨缺损被定义为一个覆盖区（距骨）。其能接触胫骨远端关节面所有运动的踝关节。右侧距骨软骨后部的骨软骨缺损被定义为一个未覆盖的区域。对于左距骨，在关节前方应用一个直切口。伸肌支持带切开后，进行关节切开术与创建距骨骨软骨缺损。修复伸肌支持带。对于右侧距骨，在跟腱内侧应用一个直切口。肌腱被横向移位，在距骨后部形成骨软骨缺损。用打孔器制造骨软骨缺损（直径3毫米，深度2毫米）。

 

显微CT与组织学评价：术后4, 8、12周用过量巴比妥钠法处死动物。从肌肉中解剖膝关节和踝关节。股骨远端和距骨固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林（pH值7）中。采用微CT对缺陷修复进行评价。左股骨远端（矢状面）矢状面切开。右侧股骨（PG）在轴向平面上切割，踝关节（距骨）在冠状面切开。10% EDTA脱钙后石蜡包埋，垂直于关节面进行切片（4μm厚），番红O-快绿染色。光镜下采用Pineda评分进行组织学评价。

Table 1

Pineda histologic score for cartilage repair 

Filling of defect (%)
125	1
100	0
75	1
50	2
25	3
0	4
Reconstruction of osteochondral junction
Yes	0
Almost	1
Not close	2
Matrix staining
Normal	0
Reduced staining	1
Significantly reduced staining	2
Faint staining	3
No staining	4
Cell morphology
Normal	0
Mostly hyaline and fibrocartilage	1
Mostly fibrocartilage	2
Some fibrocartilage, but mostly
Non-chondrocytic cells	3
Non-chondrocytic cells only	4

The score ranged from 0 (normal) to 14 (worst)

免疫组织化学分析：12周时的切片用抗原提取试剂预处理1小时，然后用0.3%双氧水处理30分钟。正常阻断血清处理30分钟，抗2型胶原的一抗（1：100）、抗1型胶原的一抗（1：250）、抗MMP13(1:15) 4°C,孵育过夜。次日使用相应二抗，并用DAB显色。定量免疫组化结果，显微镜下计数各型骨软骨缺损的免疫阳性细胞数。

 

软骨细胞增殖能力：从股骨远端和距骨处取软骨组织。从软骨组织中分离培养软骨细胞。组织切碎，37°C用胰蛋白酶孵育15分钟。之后，软骨组织用含含0.2%胶原酶改良Eagle培养基在37°C处理4 h。分离的细胞在含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素链霉素的DMEM培养液进行培养。过夜培养后，去除非贴壁细胞，贴壁细胞进一步培养于新鲜培养基中。软骨细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基的96孔板，密度为每孔5×103细胞。增殖4小时后，采用细胞计数试剂盒评估。用微孔板读数在OD 450毫米处读取数值，这些值对应于活细胞的数目。比较股骨和距骨2、3天细胞增殖率。

 

蛋白多糖的生产能力及对IL-1β的反应：软骨组织是从股骨远端和距骨圆顶获取。37℃，样品在48孔板中孵育72小时。每孔包含500μL含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液培养。将软骨样品冲洗三次后，37℃，同含IL-1β（1ng/ml）或无IL-1β无血清DMEM 500μL培养基继续培养72h。使用blyscan糖胺聚糖检测试剂盒检测集中释放的糖胺聚糖。比较股骨和距骨间质蛋白释放量与IL-1β/无IL-1β比值的变化。

 

结果：组织学评价：术后4周，在MFC和PG中观察到骨软骨缺损，并伴有少量纤维组织。在遮盖和裸露的距骨上观察到部分软骨下骨修复，缺损处充满纤维组织。8周时，MFC中观察到透明软骨修复，软骨下骨修复延迟，软骨下骨区可见软骨。在PG，未观察到透明软骨修复。在被覆盖的距骨，可见透明软骨修复，缺损处的软骨比邻近的正常软骨厚。在裸露的距骨，几乎没有观察到透明软骨修复。12周时，MFC软骨层增厚，软骨下骨修复。在PG，观察到透明软骨修复，软骨下骨板修复延迟，软骨板上可见软骨。在12周的有遮盖和裸露的距骨上，缺损处的软骨厚度与邻近软骨相似。因此，在覆盖的距骨上观察到透明软骨的修复，而不是在裸露的距骨上。Pineda评分显示：在4周时，有遮盖和裸露的距骨比MFC有更好的得分。8周时，覆盖距骨和MFC明显优于PG和裸露距骨。PG与裸露距骨有显著性差异。在12周，PG和裸露距骨之间Pineda评分差异减少。而覆盖距骨和MFC的得分明显优于裸露距骨。

 

微型CT评价：在微CT评价下，4周时在被覆盖的距骨上观察到软骨下骨的形成。在裸露的距骨中，两个样本在4周时显示软骨下形成。在MFC和PG中没有观察到软骨下形成。8周时，被覆盖的距骨显示软骨下板的重塑，缺损处的软骨板与邻近软骨下骨板相似。在三例标本中发现了距骨下软骨板的重建过程。在MFC中，软骨下板的骨形成在两个样本中开展。但没有样本显示PG软骨下板骨形成的进展。12周时，在距骨覆盖处，软骨下骨形成，软骨下骨正常。在裸露的距骨中，软骨下骨的形成有进展，但邻近软骨下骨板的水平不规则。在MFC中，除了一个样本外，观察到良好的软骨下骨形成和轮廓。在PG中，只有一个样本显示软骨下骨板的形成。

 

免疫组织化学分析：覆盖距骨的修复组织对样本2型胶原的免疫反应最高，在MFC中观察到中度阳性反应。在PG和裸露距骨，没有观察到免疫反应。1型胶原的免疫反应在MFC、PG和被覆盖的距骨中是微弱的。裸露距骨仅呈阳性染色。裸露的距骨显示出比MFC和PG更显著的免疫反应细胞。在MFC和PG处出现MMP13.高免疫反应。覆盖距骨和裸露距骨表现出中度阳性免疫反应。MFC与裸露距骨有显著性差异。

 

增殖能力：软骨细胞增殖率随时间延长而变化。第3天，距骨的软骨细胞比股骨远端软骨细胞增生较多，但无显著性差异。

 

蛋白聚糖的产生及对IL-1β的反应：为了测定蛋白多糖的释放量和对IL-1β的反应，对股骨远端和距骨的有无IL-1β反应及蛋白多糖释放试验进行了研究。股骨远端与距骨的蛋白多糖生成及对IL-1β反应无显著差异。

 

结论：与膝盖和裸露距骨相比，覆盖距骨显示早期和良好的骨软骨修复。在软骨修复之前，一致性关节在软骨修复方面优于非一致性关节。